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小麦抗条锈病SSH cDNA文库ESTs的生物信息学分析

作　者: 邱平
导　师: 张怀渝
学　校: 四川农业大学
专　业: 生物物理学
关键词: 小麦条锈病 SSH cDNA文库序列分析表达序列标签电子定位
分类号: S512.19
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

植物的抗病性是病原菌与植物相互作用的综合表现。除功能基因外,大量的调控基因在植物抗病反应中也起着重要的作用。小麦条锈病是由小麦条锈菌(Puccinia (Puccinia)striiformisf.sp tritici)引起的重要病害,严重威胁着小麦生产。通过对条锈菌病原诱导表达谱的研究,从基因组水平全面系统地认识抗性反应网络中基因间的相互关系,对分离和克隆抗病及其调控基因,获得新的分子标记,提高小麦的综合抗病性,探讨新的育种途径具有指导意义。本研究在构建了一个以抗条锈病小麦品种川农19(含抗条锈病新基因Yr41)为研究材料、条锈菌病原诱导的抑制差减杂交SSH cDNA文库的基础上,通过对该SSHcDNA文库的阳性克隆进行测序,并对测序所得有效ESTs进行序列分析、功能注释和分类,以及初步电子定位等研究,以期从基因组水平探讨条锈菌诱导小麦的抗病反应的分子机理,了解小麦抗病品种川农19与条锈菌互作过程中基因表达的特点,发掘抗条锈病相关新基因,系统研究小麦抗条锈病的分子机理以及培育抗病品种奠定基础。其主要研究结果如下：1.通过对SSH cDNA文库216个阳性克隆的测序,获得了171条有效ESTs。将其与GenBank的蛋白质和核酸数据库进行Blast比对,其中161条ESTs序列功能已知,占全部ESTs的94.2%,1条EST功能未知,9条ESTs在数据库中无相似性序列。为进一步了解功能已知ESTs所涉及的代谢反应,按照Bevan等[1]的植物基因功能分类标准,将ESTs的BLAST结果分为八类,其中,最主要的两类是抗病防御相关基因和管家基因。在抗病与防御相关ESTs中,主要有氧自由基清除相关酶类(SHMT基因、VTC2基因)、病原菌抵御蛋白(半乳糖结合凝集素lectin)、抗病调控基因(STK、水解酶类(腈水解酶)和次生代谢相关酶类(S-腺苷甲硫氨酸)等；在管家基因中,主要为参与初级代谢、能量代谢、细胞结构、转运等基因。2.通过对171个有效ESTs序列的聚类及拼接分析,获得了57个UniGenes,其中包括22个重叠群(contig)(占38.6%)和35个独立ESTs (singletons)(占61.4%),独立比例高,表明所获得的非冗余基因数量多。将获得的UniGenes与GenBank的蛋白质和核酸数据库进行Blast比对,其中45个UniGenes获得了同源序列,占全部ESTs的78.9%,有17.5%在数据库中无匹配序列。获得比对目标序列的UniGenes中,有29个(50.9%)和数据库中至少1条序列高度相似、10个(17.5%)中度相似、8个(14.1%)低度相似,根据Allona等人(1998)的理论,可以得出本研究所获得的UniGenes中有31.6%的基因是新基因,他们可能在抗病进程中起着重要作用,但其确切功能有待进一步研究。3.对171条有效ESTs通过生物信息学方法进行电子定位,最终共有34条ESTs被分别定位于除2A、2D、7A和7B外的17条染色体上,定位率为19.9%,其中有21条ESTs同时定位于同一同源染色体组ABD上,占总定位ESTs的61.2%；4条ESTs定位于不同源染色体组上,占总定位ESTs的11.2%；9条ESTs定位在单条染色体上,占总定位ESTs的27.6%。定位结果显示部分抗病相关基因被较准确的定位到了相应染色体上,这为抗病基因的克隆,表达和功能研究等提供了重要信息,也为进一步研究小麦抗病机制等提供了基础数据。

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-11
1 文献综述  11-24
  1.1 植物抗病基因(R基因)研究进展  11-13
  1.2 小麦抗条锈病基因研究进展  13-15
  1.3 表达序列标签(EST)研究现状  15-19
    1.3.1 EST的应用  17-19
      1.3.1.1 新基因的发掘和基因的表达分析  17
      1.3.1.2 基因的差异表达研究  17-18
      1.3.1.3 基因组作图研究  18
      1.3.1.4 寻找其它序列  18
      1.3.1.5 制备DNA芯片  18-19
    1.3.2 EST在小麦研究中的应用  19
  1.4 电子定位  19-22
    1.4.1 基因电子定位方法  20-21
      1.4.1.1 利用同源序列电子定位基因  20
      1.4.1.2 利用EST序列进行电子基因定位  20-21
      1.4.1.3 直接利用基因序列电子定位  21
    1.4.2 EST电子定位的特点  21-22
  1.5 重要数据库简介  22-24
    1.5.1 核酸序列数据库  22
    1.5.2 蛋白质序列数据库  22-24
研究目的与意义  24-26
技术路线  26-27
2 材料与方法  27-33
  2.1 实验材料  27
  2.2 应用软件及网络资源  27
    2.2.1 DNAStar  27
    2.2.2 序列数据库  27
  2.3 实验方法  27-29
    2.3.1 菌种活化  27-28
    2.3.2 文库检测  28-29
      2.3.2.1 检测所用引物  28
      2.3.2.2 菌液PCR  28-29
      2.3.2.3 琼脂糖电泳检测扩增产物  29
      2.3.2.4 文库阳性克隆测序  29
  2.4 EST序列分析与功能注释  29-33
    2.4.1 有效EST的获得及拼接  29
    2.4.2 EST序列及UniGene的比对分析与功能注释  29-30
    2.4.3 EST电子定位  30-33
      2.4.3.1 数据获取  30
      2.4.3.2 本地化Blast分析系统的构建  30-31
      2.4.3.3 EST的定位  31-33
3 结果与分析  33-51
  3.1 文库ESTs序列质量评价  33
  3.2 文库ESTs比对分析  33-34
  3.3 抗病进程相关基因的功能注释  34-43
    3.3.1 抗病与防御相关基因  34-38
      3.3.1.1 SHMT  34-35
      3.3.1.2 茉莉酸诱导蛋白  35-36
      3.3.1.3 热激蛋白  36-37
      3.3.1.4 自噬作用相关蛋白  37
      3.3.1.5 半胱氨酸合酶  37-38
    3.3.2 转运相关基因  38-40
      3.3.2.1 泛素蛋白  38-39
      3.3.2.2 ABC转运蛋白  39-40
    3.3.3 光合能量代谢相关基因  40-43
  3.4 EST聚类拼接  43-44
  3.5 UNIGENES比对分析及功能注释  44-47
  3.6 电子定位  47-51
4 讨论  51-57
  4.1 条锈菌诱导表达SSH CDNA序列分析  51-52
  4.2 川农19抗条锈病反应机制初探  52-54
  4.3 MYB转录因子与甘氨酸脱羧酶复合体P蛋白亚基在植物抗逆反应中的作用  54
  4.4 EST电子定位分析  54-57
参考文献  57-61
致谢  61

小麦抗条锈病SSH cDNA文库ESTs的生物信息学分析

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