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花生属种质资源遗传多样性的多种分子标记技术分析及两种新型功能型分子标记技术的开发

作　者: 熊发前
导　师: 庄伟建；唐荣华
学　校: 福建农林大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 栽培种花生花生属目标起始密码子多态性相关序列扩增多态性基础上的内含子锚定扩增多态性 BPS 遗传多样性分子标记
分类号: S565.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

栽培种花生是世界上第四大油料作物,它被广泛种植于热带和亚热带地区,中国是世界上最大的花生生产国和消费国。但是花生上的研究远远落后于其它作物,尤其在花生分子标记领域,由于栽培种花生狭窄的遗传基础,很少多态性分子标记被发现,因此,本论文的主要研究目的是:(1)应用最新的SCoT多态性分子标记技术来研究花生属资源的遗传多样性和亲缘关系,为利用野生种材料作为杂交亲本打下基础;(2)为充分理解栽培种花生的DNA多态性水平,多种随机和目标分子标记技术(SCoT,ISJAP,DAMD和URP)被用来检测栽培种花生的DNA多态性水平;(3)比较上述4种分子标记技术在检测栽培种花生多态性的效率程度;(4)开发了两种最新型目标分子标记技术,它们能在栽培种花生上检测到一定程度的DNA多态性,在其它物种上检测到丰富的DNA多态性。本论文研究的主要结果如下:1.本论文于国内外首次利用目标起始密码子多态性标记技术来研究花生属材料的遗传多样性和亲缘关系。结果表明:23条单引物共扩增出194条带,其中130条是多态性条带,聚类分析能准确地反映所研究材料间的亲缘关系。结果表明该技术能被用来研究花生属材料间的亲缘关系。2.为能在栽培种花生中获得大量的DNA多态性以及方便区别栽培种花生品种的基因型,本文首次利用目标起始密码子多态性标记技术来研究栽培种四大类型花生的遗传多样性和亲缘关系,一共筛选了36条引物,其中18条能产生清晰、可重复以及具有多态性的条带,18条引物产生了157条带,每条引物产生的条带从4到17条,平均8.72条,157条条带中有60条条带(38.22﹪)是多态性条带,每条引物能产生1到7条多态性条带,平均每条3.33条,多态比率从14.29﹪到66.67﹪,平均36.76﹪;结果揭示出,栽培种花生材料间具有非常高的遗传相似系数且并不是同一类型中的所有材料总是聚类在一起的;另外,在几种材料中发现了资源特异标记。所有这些结果显示:(1)目标起始密码子多态性标记技术能被用来检测栽培种花生的DNA多态性以及在分子水平上区别栽培种花生材料;(2)在研究栽培种花生的遗传多样性和亲缘关系上,该新型分子标记技术具有很大潜力。除栽培种花生外,该技术也能直接被用于其它植物物种上。3.栽培种花生是世界上重要的油料和经济作物之一。为了在栽培种花生中检测到大量的DNA多态性标记,三种分子标记技术(ISJAP、DAMD和URP)被用来研究栽培种花生的遗传多样性和亲缘关系并对最终结果作比较,判断这三种分子标记技术的效率程度。通过引物筛选,最终得到26条引物(14条ISJAP,,4条DAMD和8条URP)是多态性引物。14条ISJAP引物在16种栽培种花生中扩增,共扩增出121条条带,其中34条是多态性条带,每条引物在16种材料中扩增条带数从5条到12条,多态性比率从10.00%到62.50%,平均为27.74%;4条多态性DAMD引物在16种栽培种花生材料中共产生25条条带,其中16条具有多态性,每条引物在16种材料中扩增条带数从6条到7条,多态性比率从28.57﹪到50.00﹪,平均为36.31﹪;8条URP引物在16种栽培种花生中扩增,共扩增出50条条带,其中25条是多态性条带,每条引物在16种材料中扩增条带数从5条到8条,总条带数和多态性条带数平均为6.25和3.13,多态性比率从20.00﹪到80.00﹪,平均为49.53﹪。对这三种分子标记得到的结果进行比较,比较结果大概显示,URP标记相比ISJAP和DAMD标记更具效率,这三种标记的聚类结果或多或少地类似。4.根据SRAP、TRAP以及最近的CoRAP标记技术的原理,本文开发了一种基于PCR技术的新型分子标记技术,名叫相关序列扩增多态性基础上的内含子锚定扩增多态性(SRAP-IAAP),对SRAP-IAAP而言,一对引物被用来进行PCR,一条引物来自原始SRAP标记技术的正向或反向引物,另外一条引物是根据内含子拼接位点序列设计,PCR扩增条件和程序参考原始SRAP,仅做稍微改动,PCR产物通过标准的琼脂糖电泳来进行分离,本论文已将该技术应用于栽培种花生及其它2种物种的遗传多样性及亲缘关系分析上了且得到了好的结果。根据所用引物对组合的不同,该技术可以在栽培种花生、香蕉和龙眼上产生3到11条条带不等,在栽培种花生、香蕉和龙眼上产生的多态性条带所占比率分别是43.15%,80%,和79.25%。由于SRAP-IAAP标记技术所用引物的设计原理,这些引物组合可以被直接用于其它植物物种上的遗传学研究,该技术简单、方便、效率高以及无需所研究植物的基因组的序列信息,该目标分子标记技术可以作为SRAP、TRAP和最近CoRAP标记技术的有效补充,可以被应用于各个领域,比方目标数量性状位点定位、遗传多样性分析、遗传图谱构建。5.本文开发了另外一种产生分子标记的新方法,该方法使用长度从15bp到18bp的单引物进行PCR反应,单引物根据保守一致的BPS序列进行设计,PCR产物通过标准的琼脂糖电泳进行分离,本论文已将该技术应用于栽培种花生及其它3种物种的遗传多样性及亲缘关系分析上了且得到了好的结果,由于该技术所用单引物是根据基因内含子内部保守一致的短BPS序列设计的,所以这些单引物是通用的,可以被直接用于其它植物物种上的遗传学研究,该技术简单、方便、效率高以及无需所研究植物的基因组的序列信息,该技术可结合RAPD和ISSR标记技术来联合使用,可以被应用于各个领域。本论文研究结果:(1)为今后花生研究者在选择能在栽培种花生中检测到大量DNA多态性的分子标记技术提供了机会;(2)开发了两种新型分子标记技术。

全文目录

中文摘要  6-9
Abstract  9-13
1 A review on classification and development of molecular marker techniques  13-32
2 The Application of SCoT Polymorphism Marker Technique to genus Arachis  32-42
  Abstract  32
  Introduction  32-33
  Materials and methods  33-35
  Results  35-39
  Discussion  39
  References  39-42
3 Start codon targeted (SCoT) polymorphism for the evaluation of functional genetic variation and relationships in cultivated peanut (A .hypogaea L.) genotypes  42-58
  Abstract  42
  Introduction  42-44
  Materials and methods  44-47
  Results  47-51
  Discussion  51-55
  References  55-58
4 Assaying DNA polymorphism in cultivated peanut using ISJAP (semi-specific), DAMD and URP markers  58-78
  Abstract  58
  Introduction  58-60
  Materials and methods  60-62
  Results  62-72
  Discussion  72-74
  References  74-78
5 SRAP-IAAP, a new marker technique combining the sequence-related amplified polymorphism with intron anchored amplified polymorphism  78-99
  Abstract  78-79
  Introduction  79-80
  Materials and methods  80-84
  Results  84-92
  Discussion  92-95
  References  95-99
6 Molecular characterization of high plant species using PCR with primers designed from consensus branch point signal sequence  99-115
  Abstract  99
  Introduction  99-100
  Materials and methods  100-102
  Results  102-110
  Discussion  110-113
  References  113-115
致谢  115

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