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利用原生质体融合及基因工程的方法对柑橘采后生防菌34-9遗传改良的初步研究

作　者: 郭俊红
导　师: 邓伯勋；龙超安
学　校: 华中农业大学
专　业: 园艺学
关键词: 柠檬形克勒克酵母遗传改良原生质体融合基因工程
分类号: S666
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 86次
引　用: 2次
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内容摘要

生防酵母菌34-9(Kloeckera apiculata)是本实验室从自然界中自主分离得到的,对柑橘青、绿霉病具有很强的拮抗作用,但因絮凝性差、生物量低、抗菌谱窄和抑菌活性有待提高等问题,限制了其商业化应用。为了提高现有生防酵母的综合性状,迫切需要对其在基因水平上进行遗传改良,同时为进一步开发出新型、安全无毒、多功能的生物保鲜剂提供理论依据。本研究对菌株34-9的遗传改良进行了初步探索。采用双亲灭活原生质体融合技术,分析了影响亲本菌株34-9和酿酒酵母原生质体制备与再生的主要因素,明确了原生质体制备和再生的最佳条件,确立了原生质体灭活条件,对融合子进行了初步筛选和鉴定。同时利用根癌农杆菌介导的转化、醋酸锂法和电转化的转化方法,对菌株34-9转化条件进行了摸索,并对转化子进行了初步鉴定。主要研究结果如下：1.利用rDNA-ITS分子鉴定,进一步证实了菌株34-9的属、种名。确定该菌株为柠檬形克勒克氏酵母(K. apiculata),是有孢汉逊酵母属(Hanseniaspora uvarum)的无性世代。2.分别确定了菌株34-9和酿酒酵母原生质体制备和再生的适宜条件。菌株34-9原生质体制备和再生的适宜条件：采用0.05 mol/L EDTA-Na2和0.5%p-巯基乙醇混合液,28℃预处理10min；培养时间为16h；酶解液浓为1.5%的蜗牛酶,酶解时间为3h；渗透压稳定剂为0.8 mol/L的KCl溶液。酿酒酵母原生质体制备和再生的适宜条件：最适产孢培养基为Kleyn；培养时间为26 h；酶解液浓度为1.5%的蜗牛酶,酶解时间为2h；渗透压稳定剂为0.8 mol/L的蔗糖溶液。3.确立了菌株34-9和酿酒酵母原生质体灭活的适宜条件。菌株34-9化学灭活的参数：0.9%的碘乙酸作用10 min；酿酒酵母热灭活参数：55℃作用15min。在28℃条件下,利用35%PEG-4000作为促融剂进行融合。4.以菌株34-9和酿酒酵母为亲本,进行原生质体双亲灭活和融合,经过菌落大小、絮凝性检测和对峙实验初步筛选出融合子RH-1,其絮凝形成速度比对照明显快且絮凝物大；并且融合子RH-1仍具有较好的抑菌效果。5.初步确定了菌株34-9电击转化的条件：对数生长期细胞,1 mol/L山梨醇处理,20μg/mL质粒DNA,电压1.5kv,电击时间5 msec,电阻200Ω,电容25μF,电击杯0.2 cm；经初步鉴定获得5株转化子,且具有很高的遗传稳定性。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
1 前言  11-21
  1.1 柑橘采后病害的防治策略研究  11-15
    1.1.1 柑橘采后损失情况  11-12
    1.1.2 柑橘采后真菌病害的防治措施  12-13
    1.1.3 柑橘采后病害的拮抗菌  13-15
  1.2 采后生防酵母菌的研究进展  15-16
    1.2.1 采后生防酵母菌是国内外研究热点  15
    1.2.2 生防酵母菌存在的问题  15-16
    1.2.2 问题的解决途径  16
  1.3 微生物菌种改良的方法  16-17
    1.3.1 诱变育种  16-17
    1.3.2 杂交育种  17
    1.3.3 基因工程育种  17
  1.4 原生质体融合技术在遗传改良中的应用  17-19
    1.4.1 原生质体制备和再生过程中的影响因素  18
    1.4.2 原生质体融合技术的应用  18-19
  1.5 基因工程技术在遗传改良中的应用  19-20
  1.6 课题来源及意义  20-21
2 材料与方法  21-35
  2.1 试验材料  21-23
    2.1.1 菌株和质粒  21
    2.1.2 供试培养基  21
    2.1.3 主要试剂和引物  21-22
    2.1.4 试验菌株保存方法  22-23
    2.1.5 仪器设备  23
  2.2 试验方法  23-35
    2.2.1 生防酵母菌 34-9 的 rDNA-ITS 分子鉴定  23-27
      2.2.1.1 生防酵母菌 34-9 DNA 提取  23-24
      2.2.1.2 利用通用引物扩增rDNA基因簇ITS全序列  24-25
      2.2.1.3 目的片段回收  25
      2.2.1.4 PCR产物与载体连接  25-26
      2.2.1.5 大肠杆菌感受态的制备  26
      2.2.1.6 连接产物转化大肠杆菌  26-27
      2.2.1.7 重组克隆的筛选和测序分析  27
    2.2.2 生长曲线测定  27
    2.2.3 原生质体融合的方法  27-30
      2.2.3.1 酿酒酵母单倍体化  27-28
      2.2.3.2 原生质体制备  28-29
      2.2.3.3 原生质体再生  29
      2.2.3.4 致死条件的确立  29
      2.2.3.5 原生质体融合  29-30
      2.2.3.6 融合子筛选及鉴定  30
    2.2.4 基因工程的方法  30-35
      2.2.4.1 菌株 34-9 对潮霉素B的敏感性检测  30
      2.2.4.2 质粒的提取及鉴定  30-32
      2.2.4.3 根癌农杆菌介导的转化方法  32-33
      2.2.4.4 醋酸锂转化方法  33
      2.2.4.5 电转化方法  33-34
      2.2.4.6 转化子稳定性检测  34-35
3 结果与分析  35-53
  3.1 生防酵母菌 34-9 的 rDNA-ITS 序列分析  35
  3.2 利用原生质体融合的方法对菌株 34-9 进行遗传改良  35-48
    3.2.1 影响菌株 34-9 原生质体制备率和再生率的因素  35-41
      3.2.1.1 菌株 34-9 的生长曲线  35-36
      3.2.1.2 预处理对菌株 34-9 原生质体制备率和再生率的影响  36
      3.2.1.3 培养时间(菌龄)对菌株 34-9 原生质体制备率和再生率的影响  36-38
      3.2.1.4 酶解液浓度对菌株 34-9 原生质体制备率和再生率的影响  38-39
      3.2.1.5 酶解时间对菌株 34-9 原生质体制备率和再生率的影响  39-40
      3.2.1.6 渗透压稳定剂对菌株 34-9 原生质体制备率和再生率的影响  40-41
    3.2.2 影响酿酒酵母原生质体制备率和再生率的因素  41-47
      3.2.2.1 不同产孢培养基对酿酒酵母孢子形成的影响  41-42
      3.2.2.2 酿酒酵母单倍体的生长曲线  42
      3.2.2.3 培养时间(菌龄)对酿酒酵母原生质体制备率和再生率的影响  42-44
      3.2.2.4 酶解液浓度对酿酒酵母原生质体制备率和再生率的影响  44-45
      3.2.2.5 酶解时间对酿酒酵母原生质体制备率和再生率的影响  45-46
      3.2.2.6 渗透压稳定剂对酿酒酵母原生质体制备率和再生率的影响  46-47
    3.2.3 亲本致死条件  47
      3.2.3.1 菌株 34-9 的致死条件  47
      3.2.3.2 酿酒酵母的致死条件  47
    3.2.4 融合子的获得与筛选  47-48
  3.3 利用基因工程的方法对菌株 34-9 进行遗传改良  48-53
    3.3.1 菌株34-9对潮霉素B的敏感性检测  48-49
    3.3.2 质粒 pTFCM-hph 和 pFA6a-GFP(S65T)-hphMX6 的鉴定  49
    3.3.3 菌株34-9的根癌农杆菌介导的转化  49-50
    3.3.4 菌株 34-9 的醋酸锂转化  50
    3.3.5 菌株 34-9 电转化方法  50-51
    3.3.6 转化子的获得和初步鉴定  51-52
    3.3.7 转化子遗传稳定性鉴定  52-53
4 讨论  53-57
  4.1 生防酵母菌遗传改良的可行性  53
  4.2 原生质体融合  53-55
    4.2.1 融合子筛选和鉴定  53-54
    4.2.2 融合子筛选  54
    4.2.3 融合子的检测  54-55
  4.3 基因工程  55
  4.4 电击转化的效率  55-57
下一步研究计划  57-58
参考文献  58-69
在读期间发表的文章  69-70
致谢  70-71
附图及说明  71-72

利用原生质体融合及基因工程的方法对柑橘采后生防菌34-9遗传改良的初步研究

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