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多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达

作　者: 安晓雪
导　师: 杨光友
学　校: 四川农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 脑多头蚴重组抗原 Tm7 ELISA
分类号: S852.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

脑多头蚴病是由多头带绦虫(Teania Multiceps)的中绦期幼虫脑多头蚴(Coenurus cerebralis)寄生于绵羊、山羊和牛等动物脑、脊髓内引起的一种严重致死性人兽共患病。该病呈全球性分布,在我国主要以西北等牧区常见,给畜牧业造成巨大的经济损失。目前本病的诊断主要是靠典型的临床症状,若能找到一种敏感性和特异性较好的抗原用于诊断,则对于脑多头蚴病的预防和治疗有非常重要的意义。本试验从脑多头蚴的原头蚴中提取出总RNA,参照已报道的猪囊尾蚴诊断抗原NC-3基因(AJ012669)设计了一对特异性引物,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术,扩增出了一条约400bp的片段。测序结果显示Tm7基因与NC-3基因的相似性为97%,而与细粒棘球绦虫EpC1基因(AF481884)有83%的相似性。本序列包含NC-3基因完整的开放阅读框和EpC1基因的部分开放阅读框,编码由68个氨基酸组成的蛋白质,软件分析表明该蛋白质的分子量为约7.6kDa,等电点理论值为4.52,有较强的亲水性。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切将Tm7基因从pMD18-T载体上切下,插入原核表达载体pET32a(+),得到重组质粒pET32a(+)-Tm7,将其转入表达菌大肠杆菌BL21 (DE3)中,IPTG诱导表达。SDS-PAGE分析表明,在相对分子质量约27kDa处可见目的基因与表达载体的融合蛋白,而对照组pET32a(+)空质粒菌在此处没有条带。该蛋白在IPTG浓度为0.25mmol/L时于37℃诱导表达4h达到表达量的最大值。经Ni-亲和层析柱纯化后,得到纯度较高的重组蛋白。免疫印迹试验表明,羊脑多头蚴病阳性血清能够识别该抗原,说明重组蛋白有反应原性。以多头带绦虫重组蛋白Tm7作为包被抗原,羊脑多头蚴病阳性血清作为一抗,用HRP标记的兔抗羊IgG (HRP-兔抗羊IgG)为酶标二抗作间接ELISA来检测羊血清中的脑多头蚴抗体。通过对抗原包被浓度、抗体稀释度、二抗浓度、各步骤作用时间等的摸索,得出了重组抗原最适包被浓度为2.5μg/ml,血清稀释度为1：40,一抗最佳反应时间为1h,酶标二抗工作浓度为1：5000,反应时间为37℃45min,底物37℃显色15min。采用已确立的ELISA反应条件,检测了12份阴性羊的血清,依据阴阳临界值=阴性血清OD平均值+2SD,确定阴阳临界值为0.7。用此方法检测15份确诊为脑多头蚴病的羊血清,仅有1份OD值低于临界值,敏感性为93.3%；对12份阴性血清检测,均低于临界值,对5份细颈囊尾蚴病血清检测,有1例高于临界值。初步证明重组Tm7抗原有作为诊断抗原的潜力。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-11
第一章文献综述  11-28
  1.脑多头蚴病研究进展  11-13
  2.绦虫蚴病诊断抗原研究进展  13-27
    2.1 脑多头蚴病诊断抗原研究进展  13-14
    2.2 猪囊尾蚴病诊断抗原研究进展  14-21
      2.2.1 天然抗原  14-16
      2.2.2 抗原B  16
      2.2.3 小扁豆凝集素纯化抗原  16-17
      2.2.4 重组抗原  17-21
    2.3 细粒棘球蚴病诊断抗原研究进展  21-27
      2.3.1 囊液抗原  21-23
      2.3.2 原头节抗原  23
      2.3.3.囊壁抗原  23-24
      2.3.4.排泄分泌抗原(excretory-secretory products,ESP)  24
      2.3.5.重组及人工合成抗原  24-27
  3.本研究的意义  27-28
第二章多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达  28-57
  1 材料与方法  28-41
    1.1 试验材料  28-31
      1.1.1 试验样品来源  28
      1.1.2 主要试剂  28
      1.1.3 菌株和克隆载体  28
      1.1.4 常用缓冲溶液和培养基的配制  28-30
      1.1.5 主要仪器设备  30-31
      1.1.6 主要生物信息学数据库和计算机软件  31
    1.2 试验方法  31-41
      1.2.1 脑多头蚴原头蚴总RNA的提取  31-32
      1.2.2 引物设计及合成  32
      1.2.3 Tm7基因的RT-PCR扩增  32-33
      1.2.4 PCR产物的回收  33
      1.2.5 目的基因的连接和转化  33-34
      1.2.6 转化菌的PCR鉴定  34
      1.2.7 重组质粒提取  34-35
      1.2.8 pET-32a-Tm7原核表达载体构建和鉴定  35-37
      1.2.9 重组pET-32-Tm7质粒在大肠杆菌中的诱导表达  37-40
      1.2.10 目的蛋白的免疫印迹(Western-blot)检测  40-41
  2 结果  41-54
    2.1 多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆质粒的构建  41-42
      2.1.1 Tm7基因的PCR扩增  41
      2.1.2 重组克隆质粒的PCR鉴定  41-42
      2.1.3 重组质粒的序列鉴定  42
    2.2 Tm7基因的亚克隆  42-46
      2.2.1 Tm7基因阅读框的PCR扩增  42-43
      2.2.2 pMD18-T-eTm7重组质粒的构建和酶切鉴定  43-44
      2.2.3 pET32a-Tm7重组表达质粒的构建与鉴定  44
      2.2.4 pET32a-Tm7重组质粒的酶切鉴定  44-45
      2.2.5 Tm7基因的序列分析  45-46
      2.2.6 Tm7基因的同源性分析  46
    2.3 Tm7基因编码的蛋白质特征分析  46-51
      2.3.1 Tm7蛋白的氨基酸理化性质分析  46-47
      2.3.2 Tm7的二级结构预测分析  47
      2.3.3 Tm7的结构域分析  47-48
      2.3.4 Tm7蛋白三维结构预测  48
      2.3.5 Tm7的信号肽位点预测  48-49
      2.3.6 蛋白质跨膜区预测  49-50
      2.3.7 蛋白质疏水性分析  50-51
    2.4 Tm7蛋白的表达  51-54
      2.4.1 Tm7蛋白的初步表达  51
      2.4.2 诱导表达条件的优化  51-53
      2.4.3 融合表达蛋白的可溶性分析  53
      2.4.4 重组蛋白的纯化  53-54
    2.5 免疫印迹检测  54
  3.讨论  54-57
第三章脑多头蚴病间接ELISA诊断方法的建立  57-65
  1.材料  57-58
  2.方法  58-59
    2.1 间接ELISA试验各反应条件的确定  58-59
      2.1.1 抗原包被浓度及抗体稀释度的确定  58
      2.1.2 酶标二抗稀释度的确定  58-59
      2.1.3 血清最佳作用时间的确定  59
      2.1.4 酶标二抗最佳作用时间的确定  59
      2.1.5 底物显色时间的确定  59
    2.2 间接ELISA方法阴阳临界值的确定  59
    2.3 敏感性和特异性检测  59
  3.结果  59-63
    3.1 抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定  59-60
    3.2 酶标二抗工作浓度的确定  60
    3.3 血清和二抗最佳作用时间的确定  60-61
    3.4 底物显色时间的确定  61
    3.5 间接ELISA方法阴阳临界值的确定  61-62
    3.6 敏感性和特异性检测  62-63
  4.讨论  63-65
第四章结论和创新点  65-66
参考文献  66-75
致谢  75-76
攻读硕士学位期间发表的学术论文  76

多头带绦虫多头蚴Tm7基因的克隆与原核表达

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