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KLF5和hhLIM协同激活苯肾上腺素诱导的心肌肥大标志基因表达

作　者: 李英杰
导　师: 温进坤
学　校: 河北医科大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 心肌肥大 KLF5 hhLIM ANF 心肌细胞 PE
分类号: Q3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:心肌肥大是高血压、心脏瓣膜病、急性心肌梗塞及先天性心脏病等负荷性心脏病的并发症,是心肌细胞对多种病理刺激的一种适应性反应,也是导致顽固性心衰的主要原因。目前,导致心肌肥厚的病理机制尚不完全清楚。LIM蛋白是一类富含半胱氨酸且分子结构中具有一个或多个锌指结构的蛋白质家族,该家族成员广泛参与多种细胞的发育与分化调节及多种基因的转录调控。hhLIM又称为hLIM3(GenBank AF121260),是用三元递减法从人胎心cDNA文库中筛选克隆的一个与心脏生长发育有关的新基因,因其编码产物与LIM蛋白家族高度同源且氨基酸序列中含有典型的LIM结构域而得名。我们以前的研究已经证实,hhLIM是一种浆/核穿梭蛋白,在分化型细胞中,该蛋白主要分布于胞质中,通过与α-actin相互作用,诱导α-actin纤丝组装形成粗大的肌束结构,维持心肌的收缩功能。当心肌细胞受肥大因素刺激时,胞浆中的hhLIM进入细胞核内,通过与Nkx2.5相互作用,协同激活BNP和α-actin等细胞肥大相关基因的表达。Krüppel样因子(Krüppel-like factor, KLF)是一类含锌指结构的转录因子家族,主要参与调节细胞的发育、分化、增殖和凋亡等过程。KLF家族中的KLF5(又称BTEB2)是心血管重塑过程中的重要转录因子,在心肌肥大过程中扮演着重要角色。虽然已经证明hhLIM和KLF5均参与心肌肥大的发生发展过程,但二者在心肌肥大过程中的相互关系及功能联系尚不清楚。本研究探讨hhLIM与KLF5在心肌肥大发生发展过程中的相互作用,为揭示心肌肥厚的发生机制提供新的研究证据。方法:用胰蛋白酶消化法分离培养大鼠原代心肌细胞;MTT法检测苯肾上腺素(PE)对细胞增殖的影响;流式细胞分析术分析细胞周期各时相的分布情况;用Western blot分析检测KLF5、hhLIM、Nkx2.5和心钠素(ANF)表达;GST pull-down和免疫共沉淀分析法检测KLF5与hhLIM之间的相互作用;报告基因分析检测KLF5和hhLIM对ANF基因表达的影响。结果:1) PE促进原代心肌细胞肥大PE(20μmol/L)作用于原代培养的心肌细胞48 h后,心肌细胞体积较对照组相比明显增大。RT-PCR和Western blot结果显示,PE可显著诱导心肌肥大标志基因ANF和Nkx2.5表达,说明PE诱导心肌肥大的细胞模型复制成功。2) PE诱导KLF5和hhLIM表达不同浓度的PE刺激心肌细胞相同时间以及相同浓度的PE作用于细胞不同时间后,KLF5和hhLIM的表达呈剂量和时间依赖性的增加。说明KLF5和hhLIM参与PE诱导心肌肥大的发生过程。3) KLF5与hhLIM协同激活ANF基因的表达采用脂质体介导法将ANF启动子指导的报告基因质粒与hhLIM/KLF5表达质粒及内参照质粒共转染293A细胞,通过双荧光素酶报告基因检测系统定量分析启动子的活性。结果显示,在293A细胞中,单独过表达hhLIM或KLF5,均可增强报告基因的表达活性,而hhLIM和KLF5表达质粒共转染细胞时,报告基因的表达活性比其单独转染时显著升高,荧光素酶活性达对照组的2.48倍。上述结果表明,KLF5与hhLIM可以协同激活ANF基因的表达。构建hhLIM和KLF5腺病毒表达载体,转染心肌细胞,Western blot结果显示,过表达hhLIM和KLF5可以显著诱导心肌肥大标志基因ANF的表达,表明hhLIM和KLF5可以协同诱导心肌肥大的发生。4) PE促进KLF5与hhLIM的相互作用上述实验结果显示,KLF5和hhLIM协同激活ANF基因的表达。为揭示二者协同作用的分子机制,我们进行免疫共沉淀和GST pull-down实验。结果显示,在PE刺激前后的原代心肌细胞和H9C2心肌细胞中,均可检出KLF5与hhLIM相互作用,PE刺激后两者之间的结合显著增加,提示KLF5与hhLIM之间存在物理学上的相互作用,PE能够促进二者之间的相互缔合。5)敲低KLF5取消PE对ANF表达的诱导作用我们以往的实验证实,hhLIM是一种辅转录因子,因此,我们推测hhLIM激活ANF表达可能是通过与KLF5相互作用实现的。为了证实这一推测,将大鼠KLF5特异性小干扰RNA(KLF5-siRNA)导入大鼠H9C2心肌细胞,敲低PE诱导的内源性KLF5表达后,检测ANF的表达变化。结果显示,KLF5-siRNA转染的细胞与NS-siRNA转染的对照组相比,ANF的蛋白表达水平降低了59.3%,表明,KLF5介导PE诱导的ANF表达。结论:1 PE可诱导心肌肥大标志基因ANF表达和心肌细胞肥大,但不影响心肌细胞增殖及细胞周期进程。2 KLF5和hhLIM介导PE诱导的ANF表达。3 PE通过促进KLF5与hhLIM相互作用而使二者在激活ANF表达中发挥协同作用。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
第一部分苯肾上腺素诱导KLF5 和hhLIM 协同激活心肌肥大标志基因表达  11-38
  前言  11-12
  材料与方法  12-18
  结果  18-21
  附图  21-33
  讨论  33-35
  参考文献  35-38
第二部分细胞间粘附分子1 基因K469E 多态性与冠心病的关系  38-49
  前言  38
  材料与方法  38-41
  结果  41-43
  附图  43-44
  附表  44-45
  讨论  45-46
  参考文献  46-49
综述心肌肥大相关的转录因子研究进展  49-63
致谢  63-64
个人简历  64

KLF5和hhLIM协同激活苯肾上腺素诱导的心肌肥大标志基因表达

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