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腹泻性贝类毒素细胞检测方法的研究

作　者: 黄爱君
导　师: 杨汝德；刘建军
学　校: 华南理工大学
专　业: 生物化工
关键词: 腹泻性贝类毒素大田软海绵酸 HL-7702肝细胞 F-肌动蛋白
分类号: R155.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

腹泻性贝类毒素(diarrhetic shellfish poisoning,DSP)是以大田软海绵酸(okadaic acid,OA)及其衍生物为代表、摄食后可产生以腹泻为主要特征的存在于贝类体内的海洋生物毒性物质的总称。OA能够促进肿瘤形成,在极低浓度范围就可对人类健康造成潜在的威胁,其慢性毒性效益必须引起足够的重视。尽管已有多种DSP的检测方法,但这些检测方法各有其优缺点,至今尚未建立一种操作简便、快速而又可靠的常规检测方法。本研究以HL-7702肝细胞为研究对象,使用OA标准品进行DSP细胞检测方法的研究。首先从细胞增殖、形态学变化及细胞凋亡等方面探讨OA的细胞毒性效应。然后使用激光共聚焦显微镜观察和检测OA对细胞F-肌动蛋白的影响,在此基础上,进一步利用TECAN Infiite M1000多功能酶标仪定量检测OA作用细胞后F-肌动蛋白解聚效应大小,初步建立可以用于检测DSP的细胞F-肌动蛋白检测法。使用细胞F-肌动蛋白检测法进行贝类样品的检测,并将检测结果与小鼠生物法及ELISA法的样品检测结果进行比较,以验证该方法的可行性。本研究的主要结论如下:(1) OA对HL-7702肝细胞增殖的抑制呈现时间、剂量-效应关系,染毒24 h的IC50为89.684 nmol/L。(2) OA作用于HL-7702肝细胞24 h后,细胞形态发生明显变化,出现细胞凋亡形态学特征。使用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术进行细胞凋亡的检测,发现5 nmol/L OA即可诱导细胞发生凋亡,且细胞早期凋亡率随着剂量的增加而增加。(3) OA作用于HL-7702肝细胞24 h可以使F-肌动蛋白发生解聚,且解聚率与OA浓度在2.5~40 nmol/L范围内具有线性关系。(4)利用甲醇进行贝类样品的提取后需要进行氮气吹干,样品检测液中的甲醇浓度必须低于4%。(5)细胞F-肌动蛋白检测法具有良好的特异性及重复性,基质效应低,检测限可达到2.5 nmol/L,相当于2.01μg/100 g。(6)将ELISA法检测结果呈阳性的样品使用细胞F-肌动蛋白检测法进行检测,两种检测方法的检测结果具有较好的相关性。与ELISA法(检测限为10μg/100 g)相比,细胞F-肌动蛋白检测法具有更低的检测限,能更有效地保障贝类的食用安全。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
第一章绪论  13-26
  1.1 腹泻性贝类毒素的来源与分布  13-14
  1.2 腹泻性贝类毒素的理化性质  14-17
  1.3 腹泻性贝类毒素的毒性机理  17
  1.4 腹泻性贝类毒素的中毒状况  17-18
  1.5 腹泻性贝类毒素的检测方法  18-23
    1.5.1 小鼠生物法  19
    1.5.2 高效液相色谱法及相关联用技术  19-20
    1.5.3 免疫检测法  20-21
    1.5.4 生物传感器检测法  21-22
    1.5.5 蛋白磷酸酶抑制法  22-23
    1.5.6 细胞检测法  23
  1.6 本研究的意义及主要内容  23-26
    1.6.1 本研究的意义  23-24
    1.6.2 本研究的主要内容  24-26
第二章大田软海绵酸对HL-7702 肝细胞毒性效应的研究  26-36
  2.1 前言  26
  2.2 实验材料  26-28
    2.2.1 细胞  26
    2.2.2 主要仪器  26-27
    2.2.3 主要试剂  27-28
    2.2.4 培养基及试剂配制  28
  2.3 实验方法  28-30
    2.3.1 细胞培养及处理  28
    2.3.2 OA 对HL-7702 肝细胞增殖的影响  28-29
    2.3.3 显微镜观察细胞形态  29
    2.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡  29-30
    2.3.5 统计学分析  30
  2.4 结果  30-34
    2.4.1 OA 对HL-7702 肝细胞增殖的抑制率及其IC50计算  30-31
    2.4.2 OA 对HL-7702 肝细胞形态学的影响  31-32
    2.4.3 OA 对HL-7702 肝细胞凋亡的影响  32-34
  2.5 讨论  34-35
  2.6 本章小结  35-36
第三章腹泻性贝类毒素细胞F-肌动蛋白检测法的建立  36-47
  3.1 前言  36
  3.2 实验材料  36-40
    3.2.1 细胞  36-37
    3.2.2 主要仪器  37
    3.2.3 主要试剂  37-38
    3.2.4 培养基及试剂配制  38-40
  3.3 实验方法  40-42
    3.3.1 细胞培养及处理  40
    3.3.2 激光共聚焦显微镜检测F-肌动蛋白  40-41
    3.3.3 多功能酶标仪检测F-肌动蛋白  41
    3.3.4 溶剂甲醇对细胞F-肌动蛋白检测法的影响  41
    3.3.5 细胞F-肌动蛋白检测法的特异性  41-42
  3.4 结果  42-45
    3.4.1 OA 对HL-7702 肝细胞F-肌动蛋白的影响  42-43
    3.4.2 细胞F-肌动蛋白检测法标准曲线的建立  43
    3.4.3 甲醇对细胞F-肌动蛋白检测的影响  43-44
    3.4.4 细胞F-肌动蛋白检测法的特异性  44-45
  3.5 讨论  45-46
  3.6 本章小结  46-47
第四章细胞F-肌动蛋白检测法进行贝类样品的检测  47-58
  4.1 前言  47
  4.2 实验材料  47-50
    4.2.1 材料  47-48
    4.2.2 主要仪器  48-49
    4.2.3 主要试剂  49-50
    4.2.4 培养基及试剂配制  50
  4.3 实验方法  50-52
    4.3.1 细胞培养及处理  50
    4.3.2 贝类样品前处理  50
    4.3.3 细胞F-肌动蛋白检测法  50
    4.3.4 细胞F-肌动蛋白检测法的重复性  50-51
    4.3.5 样品加标回收率检测  51
    4.3.6 小鼠生物法  51-52
    4.3.7 ELISA 法  52
  4.4 结果  52-56
    4.4.1 细胞F-肌动蛋白检测法的重复性  52-53
    4.4.2 细胞 F-肌动蛋白检测法加标回收率  53
    4.4.3 三种检测方法进行贝类样品检测的结果  53-55
    4.4.4 细胞 F-肌动蛋白检测法与 ELISA 法的比较  55-56
  4.5 讨论  56-57
  4.6 本章小结  57-58
结论与展望  58-60
参考文献  60-68
攻读硕士学位期间取得的研究成果  68-69
致谢  69

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