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芸薹素合成基因PSC1导入番茄的研究

作　者: 梁成亮
导　师: 肖杰；任春梅
学　校: 湖南农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: 番茄 PSC1基因芸薹素花序浸泡法内含子
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

番茄是重要的蔬菜作物,在我国种植面积大,但单位产量低,抗逆性差,病虫害严重。为了解决这个问题,番茄的育种工作一直没有停止过,常规育种和杂交育种是番茄育种中应用最广的方法,通过育种不断创造出新品种,获得了较高产、优质、抗病虫的番茄。但是自然界已存在的番茄种植资源已被番茄育种工作者几乎全部利用完,现行的育种无疑是在已存在的种植资源中重复利用,无法再创造真正的新品种。借助转基因技术将芸薹素合成基因PSC1导入番茄,并通过基因在番茄中的过表达,使芸薹素在番茄中含量增加,从而达到增产、优质、抗逆等效果。为了将PSC1基因成功导入到番茄并表达,本研究进行了以下工作：1.建立花序浸泡法转化体系通过比较多种转基因方法的优缺点,确定了以农杆菌介导的花序浸泡法为获得转基因番茄的最佳转化法。转化菌液为农杆菌、MS、6-BA和表面活性剂Silwet L-77的悬浮液,为使转化菌液侵染活力最强,对悬浮液中各个成分的终浓度以及农杆菌培养时间都做了研究。在植株开花前5-10天用转化菌液浸泡花序,并套袋处理2-3天。植株上直接收获种子进行筛选。2.选择合适的筛选方法本文通过试验,对三种主要的筛选方法进行了比较,确定在培养皿中用Kan与营养液的混合液培养转化种子进行抗性筛选为最佳的筛选方法,并确定50mg/L为Kan最佳筛选浓度。通过筛选共得到33株阳性株。通过PCR鉴定证明外源基因已导入番茄。3.内含子增强基因表达的初步研究本研究分别将1542bp PSC1的cDNA片段和3105bp全长DNA通过分子克隆的方法连入带有35S启动子的pROK2双元载体中,分别构建了p16和p14两种转化载体,通过花序浸泡法将p16和p14导入番茄中,得到的转基因植株分别命名为T16和T14。通过观察,转基因植株的表型比对照植株高大,生长状态好。T14植株又比T16植株更高大,这初步证明了PSC1基因的内含子对该基因的表达起着增强作用。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
缩略词表  9-10
1 前言  10-21
  1.1 番茄转基因育种研究进展  10-14
    1.1.1 抗病转基因番茄  10-11
      1.1.1.1 抗病毒病  11
      1.1.1.2 抗真菌病  11
      1.1.1.3 抗细菌病  11
    1.1.2 抗虫转基因番茄  11-12
      1.1.2.1 转Bt毒蛋白基因  11-12
      1.1.2.2 转蛋白酶抑制基因  12
      1.1.2.3 转植物凝集素基因  12
    1.1.3 抗逆转基因番茄  12-13
      1.1.3.1 转抗冻基因  12
      1.1.3.2 转抗盐基因  12-13
      1.1.3.3 转抗重金属基因  13
    1.1.4 抗除草剂转基因番茄  13
    1.1.5 雄性不育和品质改良转基因番茄  13-14
      1.1.5.1 转引发雄性不育的基因  13-14
      1.1.5.2 转品质改良的基因  14
  1.2 获得转基因番茄的方法  14-17
    1.2.1 农杆菌介导法  14-15
    1.2.2 基因枪法  15
    1.2.3 花粉管通道法  15
    1.2.4 一种新的转基因方法-花序浸泡法  15-17
      1.2.4.1 花序浸泡法的原理和方法  15-16
      1.2.4.2 花序浸泡法的应用  16-17
      1.2.4.3 Silwet L-77在转化中的应用  17
      1.2.4.4 细胞分裂素在转化中的应用  17
  1.3 植物基因内含子对基因表达调控的影响  17-18
  1.4 芸薹素  18-21
    1.4.1 芸薹素在蔬菜上应用  18-20
      1.4.1.1 提高产量  19
      1.4.1.2 抗逆性增强  19
      1.4.1.3 解除药害  19
      1.4.1.4 提高品质  19-20
    1.4.2 芸薹素的生物合成途径及其突变体  20-21
  1.5 本课题的研究目的与意义  21
2 材料与方法  21-29
  2.1 材料与试剂  21-23
    2.1.1 植物材料  21
    2.1.2 酶与试剂  21-22
    2.1.3 菌株与质粒、载体  22
    2.1.4 主要溶液配制  22-23
    2.1.5 培养基  23
  2.2 实验方法  23-29
    2.2.1 番茄无菌苗获得  23-24
    2.2.2 番茄壮苗培养  24-25
    2.2.3 活化细菌  25
    2.2.4 摇菌时间对农杆菌生长的影响  25
    2.2.5 提取质粒DNA  25-26
    2.2.6 菌落PCR鉴定转化子  26
    2.2.7 农杆菌的大量培养培养  26
    2.2.8 侵染转化  26-27
      2.2.8.1 转化菌液的制备  26-27
      2.2.8.2 侵染  27
      2.2.8.3 后期工作  27
    2.2.9 最佳筛选方法的探索  27-28
      2.2.9.1 育苗床上筛选  27
      2.2.9.2 培养基上筛选  27
      2.2.9.3 培养皿上筛选  27-28
    2.2.10 Kan溶解介质的影响  28
    2.2.11 最低Kan浓度的确定  28
    2.2.12 番茄总DNA提取  28
    2.2.13 抗性植株的PCR  28-29
    2.2.14 琼脂糖凝胶电泳  29
3 结果与分析  29-37
  3.1 消毒液浸泡时间对番茄无菌苗出苗的影响  29-30
  3.2 目的片段的获得与载体构建  30-31
  3.3 摇菌时间对农杆菌生长的影响  31
  3.4 p14和p16在农杆菌中的检测  31
  3.5 番茄的侵染转化  31
  3.6 最佳筛选方法的研究  31-34
    3.6.1 育苗床上筛选  31-32
    3.6.2 培养基上筛选  32
    3.6.3 培养皿上筛选  32-34
  3.7 不同Kan浓度处理对番茄的影响  34
  3.8 Kan溶解介质的影响  34-35
  3.9 转基因番茄筛选  35
  3.10 抗性植株的PCR  35-36
  3.11 转基因植株的纯和株系筛选  36
  3.12 转基因植株的形态  36-37
4 结论与讨论  37-40
  4.1 结论  37
  4.2 讨论  37-40
    4.2.1 转化菌液的PH值  37
    4.2.2 表面活性剂浓度对转化的影响  37
    4.2.3 细胞分裂素对转化的影响  37-38
    4.2.4 悬浮液的蔗糖浓度  38
    4.2.5 侵染时间的选定  38
    4.2.6 转化子的PCR检测  38-39
    4.2.7 最佳筛选方法的探索  39
    4.2.8 转基因植株的形态  39-40
参考文献  40-45
致谢  45-46
作者简历  46

芸薹素合成基因PSC1导入番茄的研究

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