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新型纳米金胶和DNA酶的传感技术对核酸和蛋白检测的应用研究

作　者: 沈碧君
导　师: 程圭芳；何品刚；方禹之
学　校: 华东师范大学
专　业: 分析化学
关键词: SNPs 纳米金胶分子信标 P53 电化学催化 DNA酶核酸适体
分类号: Q51-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

随着人类基因组计划(HGP)的顺利完成和后基因组时代的到来,基因诊断已经成为分子生物学和生物技术研究的重要领域。脱氧核糖核酸(DNA)是生命体内的基因物质,具有传递遗传信息等功能,若在结构上稍有变动、差错、缺失或增多,就可能会导致遗传性状的改变或各种疾病的出现,因此对DNA的分析检测有助于生命科学的研究、生命活动和信息传递规律的调节。蛋白质是一类重要的生物标志物,它的分析检测在生物学、医学诊断等领域具有非常重要的意义。如果基因突变在外显引起有功能意义的突变,会导致所编码的蛋白质的表达、结构和功能的发生改变,从而影响人类的生命活动,导致基因疾病的产生。生命科学的飞速发展对基因和蛋白的检测提出越来越高的要求,开发出更灵敏,稳定和简便的生物检测技术是目前生命科学研究的热点所在。而新兴发展的以Watson-Crick碱基互补配对原则为基础的DNA生物传感器为分子生物学研究提供了全新的基因检测技术,受到生物分析工作者的高度重视。分子信标的提出正是建立在DNA碱基互补配原则的基础上,以其独特的茎-环结构,在选择性、灵敏度和特异性方面更加优于普通的直链探针,因此其在基因检测领域的应用越来越广泛。迄今为止,经过研究者们不断地改进,分子信标的功能更是得到了快速的发展,在PCR实时监控、基因突变快速分析、活体细胞动态分析及DNA与蛋白质相互作用研究等各种领域中开辟了新的途径。纳米技术的出现为生物传感器的发展提供了无穷想象的空间,基于纳米金胶的比色传感技术以其方便、快速和肉眼可见的优势在DNA生物传感器中得到了广泛的应用。纳米金胶的良好的生物相容性、简单的合成条件、大的比表面积、低廉的成本以及所具有的特殊的光学性质为比色技术的发展注入了强大的生命力,提高了比色检测的灵敏度和稳定性。随着核酸研究的深入和体外筛选技术(SELEX)的建立,核酸适体技术使抗原抗体的反应发生了新的革命性变化,在蛋白组学到来的时代以其众多的优越性弥补并逐渐替代抗体在蛋白检测中的应用。电化学核酸适体传感器结合了电化学高灵敏度、轻巧便宜、携带方便、耗能少、易微型化等优势和核酸适体对蛋白的高结合力和特异性更是成为当今生物学医学领域的前沿性课题和方向。G-四分体结构的DNA酶也是基于核酸适体-配体的思想通过SELEX技术筛选出来的一种新型的DNA酶。它是一类卟啉铁与其适体构成的具有G-四分体结构的仿辣根过氧化酶的配合物,适体为一段富含G碱基的寡聚核苷酸序列。自1998年,Sen小组提出这类DNA酶以来,它高灵敏的催化性质、易于构建、易于合成的优点,在比色和电致发光中得到了极大的发展。本文的创新之处就是利用了纳米金胶,DNA酶等简单易操作,并且廉价的的各种技术结合,建立多种检测核酸和蛋白的传感器,发展了新的基因诊断技术手段。论文主要内容如下：第一章绪论SELEX技术的发展促进了核酸适体的发展,这其中也包括G-四分体结构的DNA酶发展。本章首先介绍了DNA生物传感器尤其是电化学核酸适体传感器、分子信标技术及纳米金胶在比色检测中的分类和应用,着重介绍了分子信标技术DNA酶等的发展及应用,阐明了本论文研究的理论基础和选题依据。最后提出本论文的目的意义及创新之处。第二章分子信标标记的纳米金胶比色探针对寡聚核苷酸序列单碱基多态性的识别分子信标(MB)是一种相比于普通直链探针更灵敏地能检测单碱基错配的茎环结构的探针,因此广泛被应用在各种基因突变的检测上。本文介绍了一种利用分子信标高灵敏、高特异性识别力和纳米金凝聚变色的光学特性,设计的新型的识别单碱基多态性的比色检测方法。利用纳米金胶的自组装技术将巯基修饰的分子信标探针固定到金胶表面制得新型纳米金胶探针(AuNPs-MB),当加入不同的目标序列(完全互补序列或单碱基错配序列)与之杂交时,使金胶表面构象改变及引起金胶体系熵焓的差异性：即在适当盐度条件下,导致金胶不同程度的聚集,从而实现对单碱基错配几率和不同位点的识别。最后,将该比色传感体系应用在对P53基因的检测上,同样能够有效区分野生型和突变型P53基因,实现对单碱基多态性的识别。实验结果显示,利用该金胶比色方法,操作简单,成本低廉,对单碱基错配在混合目标体系中的分辨率能达到至少5%。第三章基于G-四分体结构的DNA酶电化学核酸适体传感器信号扩增检测凝血酶本文构建了一种结合核酸适体技术和DNA酶的特性,以凝血酶蛋白作为研究对象的高效、高灵敏度、特异性识别蛋白质的电化学催化检测的方法。凝血酶的核酸适体是一段富含G碱基的寡聚核苷酸序列,它被证实能与卟啉铁配位形成一定的G-四分体结构,当其结合目标凝血酶时,该结构就会进一步转化成牢固的DNA酶超分子结构,表现出与辣根过氧化酶相似的催化特性,能对双氧水进行很强的催化氧化,从而应用在电化学上对双氧水的催化氧化来检测凝血酶蛋白。该方法通过将DNA酶固定在金电极表面,结合电化学的高灵敏度,在有双氧水存在的情况下,得到催化电流与凝血酶浓度对数值在1×10-10～1×10-6 mol／L范围内线性相关,检测限可以达到6×10-11mol／L.相关系数为r=0.994,对凝血酶蛋白的检测限可达到6×10-11M。并且该方法对凝血酶蛋白具有很好的特异性,其它蛋白如牛血清白蛋白、溶菌酶等均对凝血酶的检测基本无干扰。此新型的生物传感器制备简单,灵敏度和特异性高,为凝血酶的检测提供了一种新的手段。

全文目录

论文摘要  6-9
ABSTRACT  9-16
第一章绪论  16-41
  一.纳米金胶在DNA生物传感器中的应用  17-20
  二.分子信标技术的原理和应用  20-26
    1.分子信标的结构和原理  21-22
    2.分子信标的应用  22-26
    3.分子信标的展望  26
  三.核酸适体生物传感器及其研究进展  26-32
    3.1 核酸适体电化学生物传感器的原理  27-31
    3.2 核酸适体电化学生物传感器的展望  31-32
  四.DNA酶在蛋白和DNA检测中的应用  32-35
    4.1 G-四分体DNA酶的结构和性质  32-33
    4.2 DNA酶化学发光生物传感器中的应用  33
    4.3 DNA酶在比色检测中的应用  33-34
    4.4 DNA酶的展望  34-35
  五.本论文的目的和意义  35-36
    1.分子信标标记的纳米金胶比色探针对寡聚核苷酸序列单碱基多态性的识别  35-36
    2.基于G-四分体结构的DNA酶电化学核酸适体传感器信号扩增检测凝血酶  36
  参考文献  36-41
第二章分子信标标记的纳米金胶比色探针对寡聚核苷酸序列单碱基多态性的识别  41-60
  摘要  41
  一.引言  41-43
  二.实验部分  43-49
    2.1 试剂与仪器  43-47
    2.2 实验方法  47-49
  三.结果与讨论  49-57
    3.1 金胶表面探针密度的估计  49-50
    3.2 AuNPs-MB1检测体系中MgCl_2浓度的影响  50-52
    3.3 AuNPs-MB1的选择性  52-54
    3.4 AuNPs-MB1的SNPs定量检测  54-56
    3.5 对P53基因的SNPs的识别  56-57
  四.结论  57-58
  参考文献  58-60
第三章基于G-四分体结构的DNA酶电化学核酸适体传感器信号扩增检测凝血酶  60-74
  摘要  60
  一.引言  60-62
  二.实验部分  62-63
    2.1 试剂与仪器  62-63
    2.2 实验过程  63
  三.结果与讨论  63-71
    3.1 电化学交流阻抗和循环伏安对传感器的表征  64-66
    3.2 传感器电化学行为的研究  66-68
    3.3 TBA/Hemin/Thrombin电极的对H202的电催化还原  68-69
    3.4 凝血酶的定量检测  69-70
    3.5 传感器对凝血酶检测的特异性  70-71
  四.结论  71-72
  参考文献  72-74
附录  74-76
致谢  76-77

新型纳米金胶和DNA酶的传感技术对核酸和蛋白检测的应用研究

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