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细粒棘球蚴重组抗原EgP-29免疫小鼠的动态研究

作　者: 罗永云
导　师: 李昭宇；赵巍
学　校: 宁夏医科大学
专　业: 外科学
关键词: 细粒棘球蚴 重组抗原EgP-29 免疫保护机制
分类号: R392
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


目的利用已完成免疫学特性鉴定的细粒棘球蚴(Echinococcus granulosus, Eg)P-29重组蛋白免疫ICR小鼠后,用活的原头蚴攻击感染;动态观察免疫小鼠血清IgE、IgG及其亚类的变化规律;脾T细胞CD4+和CD8+亚群的变化;以及脾细胞培养上清液IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α和IL-10的变化水平;观察实验动物产生的保护力;从而阐述其保护性免疫机制,为CE疫苗的开发利用提供依据。方法(1)制备抗原及定量:用已成功构建的基因工程菌株EgP-29/pET-28a/BL21(DE3)plysS进行诱导表达、鉴定、纯化、制备出重组抗原并定量;(2)实验动物分组:选取雌性ICR小鼠随机分为3组:实验组既抗原接种组、佐剂+PBS组和对照组即PBS组;(3)动物免疫:实验组注射重组抗原+佐剂+PBS100μl,共三次,每次间隔两周,后两次将弗氏完全佐剂改为弗氏不完全佐剂;佐剂+PBS组采用如上注射方法,每次注射:PBS50μl+弗氏完全佐剂50μl,(后两次亦改为弗氏不完全佐剂);PBS组则采用如上注射方法,每次注射:PBS100μl;(4)动物攻击感染:免疫后8周,各组均以2000个活的原头蚴/每只小鼠攻击感染;(5)脾细胞悬液的制备和血清的收集:小鼠接种疫苗后在0、2、4、6w及攻击感染后在10w、18w、26w分别从眼球采血收集血清并分离脾细胞,每次每组5只;(6)通过ELISA及FCM:①观察免疫后、攻击感染后不同时间IgE、IgG及其亚类的变化规律;②用ConA刺激脾细胞培养后,检测其上清液中IFN-γ、IL-2、IL-4、TNF-α和IL-10的变化水平;③分离脾细胞后,应用FCM检测T细胞CD4+和CD8+亚群的百分比变化;(7)免疫保护力观察:计算免疫保护力。结果(1)经过酶切鉴定,纯化的EgP-29重组蛋白在SDS-PAGE上分子量29KDa处见明显表达条带,抗原制备成功;(2)经“SmartSpectTM3000”微量蛋白核酸分析定量重组蛋白EgP-29的浓度为8.3μg/μl ;(3)ICR小鼠接种原头蚴26w后,切开腹腔发现数个大小不等的包囊,说明棘球蚴模型制作成功;(4)实验组(rEgP-29)与对照组(PBS)经统计学检验比较:①rEgP-29组小鼠在抗原免疫后和攻击感染后均产生高水平的IgG、IgG1、IgE、IgG3抗体(P<0.01 ),提示IgG、IgG1、IgE、IgG3可能参与保护性的免疫应答机制;②rEgP-29组小鼠在攻击感染后不仅CD4+T细胞增加(P<0.01 ),CD8+T细胞也有轻度增加(P<0.05 ),提示rEgP-29的保护机制不仅有CD4+T细胞的参与,可能也有CD8+T细胞的作用;③rEgP-29组小鼠在攻击感染后产生高水平的IL-2(P<0.05 ),低水平的IL-4和IFN-γ(P<0.05 ),提示该重组抗原以诱导Th1型免疫应答为主的反应;(5)根据Dempster公式计算:rEgP-29抗原免疫ICR小鼠可获得90%的免疫保护力,提示rEgP-29能诱导小鼠产生较强的免疫保护力。结论rEgP-29能诱导小鼠产生较强的免疫保护力,其保护性免疫机制主要通过诱导宿主产生体液免疫应答和Th1型免疫应答,表明rEgP-29是具有发展潜力的抗包虫病候选疫苗。

全文目录


摘要  4-6
ABSTRACT  6-8
符号说明  8-11
前言  11-14
实验内容  14-15
一 重组抗原 rEgP-29 的鉴定、表达、纯化、定量  15-21
  1 重组蛋白 rEgP-29 的鉴定、表达、纯化  15-21
  2 重组抗原的定量  21
二 细粒棘球蚴重组 EgP-29 疫苗免疫小鼠的动态观察  21-52
  (一) 细粒棘球蚴重组 EgP-29 疫苗免疫后小鼠 I gE、I gG 及其亚类的动态观察  21-35
  (二) 细粒棘球蚴重组 EgP-29 疫苗免疫后小鼠 T 淋巴细胞亚群的动态观察  35-41
  (三) 细粒棘球蚴重组 EgP-29 疫苗免疫后小鼠 细胞因子的动态观察  41-51
  (四) 细粒棘球蚴重组 EgP-29 疫苗免疫小鼠后 免疫保护力的观察  51-52
三 讨论  52-56
结论  56-57
参考文献  57-60
文献综述  60-68
  参考文献  66-68
附录  68-76
致谢  76-77
攻读学位期间发表的学术论文  77-78
个人简历  78

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 医学免疫学
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