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急慢性酒精中毒大鼠脑组织Ngb、HIF-1α、Epo表达及神经元凋亡与TSAH死亡机制的研究

作　者: 吴伟聪
导　师: 徐小虎；于晓军
学　校: 汕头大学
专　业: 法医学
关键词: TSAH 酗酒 Ngb HIF-1α Epo 神经元氧代谢法医病理学
分类号: R595.6
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景与目的外伤性蛛网膜下腔出血(traumatic subarachnoid haemorrhage,TSAH)是一种不同于与脑挫伤所致的蛛网膜下腔出血和病理性蛛网膜下腔出血的独立脑蛛网膜下腔出血,外伤性蛛网膜下腔出血与外伤性硬脑膜外出血、硬脑膜下腔出血并列为外伤性颅内三大腔隙出血。国内外的调查研究发现,TSAH多数是发生在大量饮酒后,经轻微暴力作用于头面部发生,发生率高达87%。本课题组既往研究,建立了大鼠急慢性灌酒后TSAH模型:灌酒后大鼠TSAH发生率为急性组28.6﹪、慢性组82.4﹪,死亡率为急性组0﹪、慢性组58.8﹪,从脑组织Ngb、HIF-1α、Na+,K+-ATPase等氧和能量代谢、tPA和MMP-9等血管壁和神经细胞毒性、血管形态结构及其生物力学三个方面,初步探讨了饮酒促发TSAH的发生机制。同时,发现了慢性灌酒组的脑组织暗神经元明显多于急性灌酒组,但是慢性灌酒大鼠TSAH高死亡率及其死亡机制是否与暗神经元之间存在关系,则尚不清楚。而这正是关于TSAH案例法医学鉴定、死因分析,及其司法审判量刑中极其重要而迫切需要解决的问题之一。本研究旨在前期所建立的大鼠灌酒后TSAH模型基础上,观察脑组织脑红蛋白(Ngb)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)、促红细胞生成素(Epo)等脑组织氧代谢指标的表达,及凋亡因子Bcl-2、Bax,脑组织细胞凋亡、暗神经元数量的变化,探讨急慢性酒精中毒对脑组织形态、代谢和功能的影响,及TSAH高死亡率的相关机制,以期为此类案件的法医学鉴定和临床防治提供科学理论依据。材料与方法动物及分组:雄性SD大鼠80只,体重300-400g,常规分笼饲养,随机分组。急性灌酒模型:40只大鼠随机分:急性灌酒组,一次性胃内灌酒(北京红星酒厂二锅头,52%v/v)15ml/ kg;急性灌水组,灌同等量的自来水;再分别于灌酒或灌水后2h,给予脑震荡性打击,建立灌酒打击组和灌水打击组模型,每组各10只。慢性灌酒模型:40只大鼠随机分:慢性灌酒组和灌水组,给予灌酒(北京红星酒厂二锅头,52%v/v)或灌水四周,每天9:00和15:00间隔6小时灌两次,前2周每次灌8ml/kg、后2周每次灌12ml/kg。最后一次灌酒和灌水后2h,给予脑震荡性打击,建立灌酒打击组和灌水打击组明显,每组各10只。未打击组于灌胃后2h,打击组于打击后0.5h,开胸暴露心脏,经左心室-主动脉插管,直接灌注4%中性多聚甲醛液处死兼固定,剪开右心耳放血。约0.5h后开颅取全脑,水冲洗后,置于4%中性多聚甲醛固定6小时,脱水、浸蜡、包埋,常规制作石蜡组织切片厚约5um,分别HE染色观察脑组织形态变化,Ngb,HIF-1α,Epo,Bcl-2和Bax免疫组织化学染色,及TUNEL标记细胞凋亡,观察其表达情况。病理真彩色图像分析系统4.0进行体视量化病理学观测,实验数据用SPSS15.0统计软件(Independent-samples T-test and One-way ANONA)及Excel进行分析处理。结果1血酒精浓度变化和行为学表现急性灌酒后2 h时大鼠血酒精浓度114.67±67.37 mg/dL,灌酒后短时间内,大鼠兴奋性较强、步态不稳,不停靠墙走动;0.5 h后逐渐出现侧卧、翻正反射消失、昏睡、呼吸缓慢等急性酒精中毒表现;2h后呼吸频率63.5±9.4次/分和血压106.1±4.6mmHg均较灌酒前85.1±9.3次/分和133.8±5.5mmHg显著下降(P<0.01)。单纯灌水组灌水前后血压、呼吸无明显变化。急性灌酒打击组和灌水打击组大鼠,打击后0.5 h血压121.1±17.6 mmHg较打击前106.5±10.1 mmHg明显升高(P<0.05),呼吸频率未见明显改变。慢性灌酒组大鼠饲养期间逐渐出现毛发粗糙发黄、无光泽、精神萎靡、两眼无神、进食量减少、基础血压升高、体重增长缓慢或下降等。2周后体重为372.8±22.2g较灌酒前的389.7±31.7g明显下降(P<0.05);灌水组大鼠第4周体重为405.1±20.8g较灌水前的390.1±24.7g增长明显(P<0.05);大鼠灌酒后第四周基础血压为152.3±13.5mmHg较灌酒前的135.0±11.2上升(P<0.05),最后一次灌酒后血压为140.3±10.4较灌酒前的152.3±13.5 mmHg低(P<0.05),打击后升高为151.2±10.6mmHg(P<0.05)。灌水打击组打击后血压为148.1±13.5mmHg较打击前137.1±12.6mmHg高(P<0.05)。单纯灌水组大鼠基础血压未见明显改变。灌酒和灌水组大鼠基础呼吸频率均未发生变化,仅每次灌酒后出现呼吸频率降低(P<0.05),打击后呼吸频率未见明显改变(P>0.05)。2 TSAH、SAH发生率、死亡率及病理学观察急性灌酒打击组大鼠TSAH发生率20%,无死亡。慢性灌酒打击组的TSAH发生率50%,死亡率约40%。急慢性灌水打击组均未发现TSAH。急性单纯灌酒对照组1只出现自发性SAH。急性灌水组大鼠脑表面光泽,表面散在细小血管纹理。急性灌水打击组大鼠脑表面较苍白,细小血管纹理细少或消失。急性单纯灌酒组脑表面光泽,大片淤血,发生自发性SAH的脑干腹侧薄层斑片状蛛网膜下腔出血。急性灌酒打击组大鼠TSAH呈薄层斑片状出血,主要分布在脑干腹侧面,脑组织神经元轻度水变性、细胞周隙略扩大,偶见固缩深染的暗神经元细胞、尼氏小体消失。慢性灌酒组大鼠脑表面光泽,大片淤血,可见散在暗神经元细胞,呈暗紫红色均质化、胞体皱缩、胞浆及胞核浓缩,核不清或消失,轴突不规则扭曲,多见嗜神经现象,神经元数量减少,胶质细胞增生。慢性灌酒打击组大鼠发生TSAH的脑表面大片较厚层蛛网膜下腔出血,主要分布在脑干腹侧面,神经元及胶质细胞中度水变性、细胞周隙明显扩大、尼氏小体消失。3 Ngb表达观察急慢性灌水及灌水打击对照组大鼠脑神经元内均有少量Ngb的表达。急慢性灌酒组和急慢性灌酒打击组大鼠脑组织各区Ngb阳性细胞数,IOD值分别高于急慢性灌水组和急慢性灌水打击组(P<0.01)。急性灌酒打击组Ngb阳性细胞数23.0±3.48多于急性灌酒组19.7±2.37 (P <0.01)。慢性灌酒打击组的Ngb阳性细胞数20.0±2.67及IOD值4070.3±226.12与慢性灌酒组阳性细胞数18.0±2.83、IOD值3922.5±319.62有显著的统计学意义(均为P <0.01)。慢性灌酒组的Ngb阳性细胞数18.0±2.83低于急性灌酒组19.7±2.37 (P <0.01),而慢性灌酒打击组脑组织各区NgbIOD值4070.3±226.12与急性灌酒打击组6380.6±234.21有统计学意义(海马、小脑区P <0.01,脑干区P <0.05)。4 HIF-1α表达观察急慢性灌水及灌水打击对照组大鼠脑神经元内有散在少量细胞HIF-1α轻度表达。急慢性灌酒组和急慢性灌酒打击组大鼠脑组织各区HIF-1α阳性细胞数,IOD值分别高于急慢性灌水组和急慢性灌水打击组(P<0.01)。急性灌酒打击组HIF-1α阳性细胞数24.2±4.82多于急性灌酒组21.2±3.25 (P<0.01)。慢性灌酒打击组的HIF-1αIOD值3862.6±289.24也高于慢性灌酒组3502.7±312.91(P<0.01)。慢性灌酒组的脑组织各区HIF-1α阳性细胞数18.5±2.45,IOD值3502.7±312.91低于急性灌酒组21.2±3.25、3878.6±212.31 (均为P<0.01),而慢性灌酒打击组脑组织HIF-1α阳性细胞数21.1±2.46也比急性灌酒打击组24.2±4.82要少(P<0.01)。5 EPO表达观察急慢性灌水及灌水打击对照组大鼠脑神经元内有散在少量细胞Epo表达。急慢性灌酒组和急慢性灌酒打击组脑组织各区Epo阳性细胞数,IOD值分别高于急慢性灌水组和急慢性灌水打击组(P<0.01)。急性灌酒打击组Epo阳性细胞数21.9±3.55多于急性灌酒组20.0±3.00(P<0.01)。慢性灌酒打击组的EpoIOD值3821.6±336.21也比慢性灌酒组3654.1±304.74要高(P<0.01)。慢性灌酒组的脑组织各区Epo IOD值3654.1±304.74均低于急性灌酒组3908.1±312.81(P<0.01) ,而慢性灌酒打击组脑组织各区EpoIOD值3821.6±336.21也均低于急性灌酒打击组4192.6±351.62 (P <0.01)。6 Bcl-2,Bax的表达观察及Bcl-2/Bax的比值急慢性灌酒组和急慢性灌酒打击组大鼠脑组织各区Bcl-2和Bax的阳性细胞数分别高于急慢性灌水组和急慢性灌水打击组(P<0.01)。急性灌酒打击组Bcl-2 IOD值2952.9±358.08多于急性灌酒组2782.7±381.22(P<0.01)。慢性灌酒组的脑组织各区Bcl-2IOD值2638.3±346.43均低于急性灌酒组2782.7±381.22(P<0.01),而慢性灌酒打击组脑组织各区Bcl-2 IOD值2720.7±352.76均比急性灌酒打击组2952.9±358.08要低(P<0.01)。急性灌酒打击组脑组织各区Bax阳性细胞数11.2±2.78多于急性灌酒组10.4±2.44(P<0.05)。慢性灌酒组的脑组织各区BaxIOD值2806.3±282.35高于急性灌酒组2618.7±223.61。(P<0.01)急性灌水及灌水打击组各脑区Bcl-2/Bax的平均比值分别为1.090、1.083,慢性灌水及灌水打击组分为1.053、1.081,急性灌酒及灌酒打击组为1.144、1.188,以上各组比值均大于1,而慢性灌酒及灌酒打击组各脑区Bcl-2/Bax的比值为0.946、0.912,比值均小于1。7 TUNEL标记细胞凋亡结果慢性灌酒组和慢性灌酒打击组可见较多的黄棕色阳性细胞,慢性灌酒组和慢性灌酒打击组大鼠脑组织各区细胞凋亡阳性细胞数4.4±0.52、4.9±0.57均分别高于慢性灌水组1.8±0.42和慢性灌水打击组1.9±0.57 (P<0.01),同时也高于急性灌酒组1.8±0.42及急性灌酒打击组1.6±0.52 (P<0.01)。慢性灌酒打击组的脑组织各区阳性细胞数4.9±0.57也高于慢性灌酒组4.4±0.52 (P<0.05)。结论1、急慢性酒精中毒可促发TSAH,慢性酒精中毒与TSAH高发生率及死亡率之间存在显著相关性。提示酗酒后TSAH及其死亡案件的死因分析时,应充分考虑酒精的急慢性毒理学效应,其在TSAH死亡案件中与头颈部外伤应属于协同死因。2、慢性酒精中毒可通过抑制脑组织Ngb、HIF-1α、Epo等氧代谢通路相关因子表达,Bcl-2/Bax比值明显降低、神经细胞凋亡及暗神经元数量明显增加,可能参与酒精性脑萎缩、脑功能障碍的发生机制。3、证实了急慢性酒精中毒可诱发脑组织暗神经元出现,特别是明显酒精中毒的暗神经元可能构成酗酒后TSAH及其死亡的重要的神经病理学基础,参与死亡机制的过程。

全文目录

中文摘要  5-10
英文摘要  10-15
缩略语释义表  15-16
前言  16-18
材料与方法  18-25
结果  25-51
讨论  51-55
结论  55-56
参考文献  56-60
附图  60-73
  附图1 对照组及急慢性组大鼠脑组织大体图片  60-61
  附图2 对照组及急慢性组大鼠脑组织 HE 染色图片  61-63
  附图3 对照组及急慢性组大鼠脑组织 Ngb 免疫组化图片  63-65
  附图4 对照组及急慢性组大鼠脑组织 HIF-1α免疫组化图片  65-66
  附图5 对照组及急慢性组大鼠脑组织 Epo 免疫组化图片  66-68
  附图6 对照组及急慢性组大鼠脑组织 Bcl-2 免疫组化图片  68-69
  附图7 对照组及急慢性组大鼠脑组织 Bax 免疫组化图片  69-71
  附图8 对照组及急慢性组大鼠脑组织 TUNEL 标记细胞凋亡图片  71-73
文献综述  73-88
个人简介及发表论文情况  88-89
致谢  89-90

急慢性酒精中毒大鼠脑组织Ngb、HIF-1α、Epo表达及神经元凋亡与TSAH死亡机制的研究

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