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非洲菊主要病毒组培脱毒方法的研究及脱毒效果的快速检测

作　者: 张丽莉
导　师: 马青；杨翠云
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 植物病理学
关键词: 非洲菊多重RT-PCR 实时荧光RT-PCR 脱毒
分类号: S436.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 122次
引　用: 2次
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内容摘要

非洲菊(Gerbera jamesonii Bolus)在我国口岸进出口数量多且生产规模大,但易受到多种病毒的为害。目前还未见非洲菊脱毒处理和病毒检测的相关研究。本研究在非洲菊上同时接种番茄黑环病毒(Tomato black ring virus,TBRV)、烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV),进行脱毒处理和检测方法的研究。本研究采用茎尖、叶片、花托组织培养、培养基添加病毒A以及热处理结合茎尖脱毒的方法,对接种4种病毒的非洲菊种苗进行了外植体脱毒试验,发现采用茎尖和花托脱毒方法均可得到非洲菊脱毒苗。非洲菊茎尖和花托愈伤组织脱毒成功在国内尚属首例。对为害非洲菊5种主要病毒进行检测方法的研究,成功建立了同步检测非洲菊上番茄黑环病毒(TBRV)、烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV) 3种病毒的多重RT-PCR方法;建立了同步检测番茄斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSWV)、烟草脆裂病毒(TRV)和烟草花叶病毒(TMV) 3种病毒的多重RT-PCR方法;分别建立了4种病毒灵敏特异的实时荧光RT-PCR方法。两种多重RT-PCR方法均可一次性扩增出3种病毒的DNA条带。TBRV、TMV和CMV的多重RT-PCR方法可检测相当于1μg的混合带毒叶片;TSWV、TRV和TMV的多重RT-PCR方法可检测相当于1mg的混合带毒叶片;而实时荧光RT-PCR方法灵敏度更高,可分别检测相当于1ng、1ng、100pg和1μg的TBRV、TMV、CMV和TSWV带毒叶片。利用建立的多重RT-PCR方法和实时荧光RT-PCR方法进行了脱毒效果的检测,结果发现采用两种方法检测到的茎尖脱毒率最高分别为75.0%和66.7%,花托脱毒率分别可达52.0%和54.5%。试验结果表明采用茎尖、花托组织培养的脱毒方法均能获得完全脱毒苗。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
第一章文献综述  9-23
  1.1 植物脱毒技术研究进展  9-12
    1.1.1 热处理脱毒法  9-10
    1.1.2 茎尖培养脱毒法  10
    1.1.3 热处理结合茎尖培养脱毒法  10-11
    1.1.4 抗病毒药剂脱毒法  11
    1.1.5 抗病毒药剂结合茎尖培养脱毒法  11
    1.1.6 微体嫁接培养法  11-12
    1.1.7 其他脱毒技术  12
  1.2 植物病毒检测技术研究进展  12-21
    1.2.1 生物学检测法  13
    1.2.2 免疫学检测法  13-15
    1.2.3 电子显微镜检测法  15-16
    1.2.4 分子生物学检测法  16-21
    1.2.5 展望  21
  1.3 研究的目的和意义  21-23
第二章非洲菊主要病毒组培脱毒技术研究  23-34
  2.1 材料与设备  23
    2.1.1 试验材料  23
    2.1.2 试验所用的仪器及试剂  23
  2.2 试验方法  23-29
    2.2.1 前期制备  23-27
    2.2.2 脱毒方法  27-28
    2.2.3 继代培养  28-29
  2.3 试验结果  29-33
    2.3.1 不同培养基脱毒效果的比较  29-30
    2.3.2 不同脱毒方法的比较  30-33
  2.4 讨论  33-34
第三章非洲菊主要病毒分子检测方法的建立  34-55
  3.1 试验材料及仪器试剂  34-35
    3.1.1 试验材料  34
    3.1.2 试验所用仪器及试剂  34-35
  3.2 试验方法  35-42
    3.2.1 病毒接种（机械接种）  35
    3.2.2 引物及探针设计  35-37
    3.2.3 双抗体夹心-酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)  37-38
    3.2.4 病毒RNA 的提取  38-39
    3.2.5 5 种病毒不同分离物的RT-PCR  39-40
    3.2.6 TBRV、TMV 和CMV 3 种病毒多重RT-PCR  40
    3.2.7 TSWV、TRV 和TMV 3 种病毒多重RT-PCR  40-41
    3.2.8 实时荧光RT-PCR  41
    3.2.9 不同检测方法的灵敏度  41-42
  3.3 结果与分析  42-54
    3.3.1 生物学接种  42
    3.3.2 DAS-ELISA 检测  42-43
    3.3.3 5 种病毒不同分离物的RT-PCR  43-45
    3.3.4 TBRV、TMV 和CMV 3 种病毒多重RT-PCR  45-46
    3.3.5 TSWV、TRV 和TMV 3 种病毒多重RT-PCR  46-47
    3.3.6 实时荧光RT-PCR  47-49
    3.3.7 不同检测方法的灵敏度  49-53
    3.3.8 脱毒效果的检测  53-54
  3.4 讨论  54-55
第四章结论  55-56
参考文献  56-63
附录  63-67
致谢  67-68
作者简介  68

非洲菊主要病毒组培脱毒方法的研究及脱毒效果的快速检测

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