学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

MiR396在烟草中的功能分析

作　者: 杨凤玺
导　师: 余迪求
学　校: 中国科学院研究生院（西双版纳热带植物园）
专　业: 植物学
关键词: miR396 NtGRF-like 窄叶 干旱 气孔数目 韧皮部运输
分类号: S572
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 76次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


植物MicroRNAs (miRNAs)是由具有发夹结构的单链RNA前体(约70-90个碱基大小)经过Dicer-like酶加工后生成的具有调控功能且大小约21个碱基的小分子RNA。MiR396是Jones-Rhoades等于2004年首先在拟南芥中发现的,同时通过5’RACE证实了部分AtGRF基因家族成员(AtGRF1、AtGRF2、AtGRF3、AtGRF7、AtGRF8、AtGRF9)是miR396的靶基因。EST序列分析发现miR396在15个不同的物种中存在,是高度保守的小分子,并且其初始转录体和成熟的miRNA都具有高度保守性,特别是成熟miRNA序列及其互补序列,这表明miR396可能在植物发育方面具有重要且保守的功能。利用其高度保守性,本研究通过在烟草中高表达拟南芥miR396来分析miR396在烟草中的功能。用拟南芥miR396a互补序列做探针,通过Northern杂交检测后,发现烟草中有很高的miR396的表达水平,也证实了烟草中miR396的存在。我们采用基因克隆的方法将拟南芥miR396前体a重组为高表达质粒35S::AthMIR396a)后,通过农杆菌侵染叶片法获得转基因烟草。miR396的高表达转基因植株中,miR396的表达量比对照明显增强,经观察发现miR396高表达转基因烟草植株矮化且叶片变窄,花发育异常,这些与本实验室之前的研究结果,即miR396通过负调控AtGRF1-AtGRF3来调控叶的形态发育导致高表达miR396的拟南芥转基因植株矮化且叶片变窄相一致。通过搜索烟草EST数据库,我们得到四个与AtGRF高度同源并具有WRC保守域的EST序列)GenBank Ace:FG137771, FG165999, FG167390和FG194560),同时他们都含有与miR396互补序列,由此我们推测它们为miR396在烟草中潜在的靶基因。RT-PCR分析结果表明高表达转基因烟草中除了FG167390外其余三个EST序列的mRNA水平明显降低,从而证实了我们的假设,即miR396在烟草中负调控NtGRF-like基因。MiR396受干旱诱导表达,同时miR396也可以提高烟草的耐旱性。MiR396高表达转基因植株矮小,叶变窄,是耐旱植物的典型特征。野生型和转基因植株在相同的环境生长8周后,进行干旱处理3周。结果发现35S：：MIR396a转基因植株仍能正常生长且比三周前有明显长高,而野牛型已完全萎蔫。用10%PEG6000处理3周大幼苗4小时也得到同样的结果。为了阐明miR396提高拟南芥抗旱性的机制,我们分别测定了高表达和对照植株的失水率和相对含水量,发现高表达植株有更强的保水能力。通过激光共聚焦扫描叶下表皮,发现miR396高表达转基因植株叶的气孔密度降低。由于大部分水分是通过气孔扩散的,且通过气孔的蒸腾量一般可达与叶面积相同的自由水面蒸发量的50%,甚至可达100%,所以气孔密度降低会提高拟南芥的保水能力,有利于拟南芥在干旱环境下生长。另外我们检测了小分子在植物体内的传递,发现将高表达miR396的转基因烟草植株去顶接上野生型嫩芽,生长4周后野生型嫩芽新生的叶片中的miR396表达量提高；而将野生型植株作为砧木上接高表达miR396的转基因嫩芽生长4周后,野生型砧木新生的侧枝嫩叶中miR396表达量无明显变化,说明miR396能延茎轴方向向上传递而不能往下运输。综上所述,miR396可以通过负调控NtGRF-like来调控叶的形态发育；miR396提高拟南芥的抗旱性是由于miR396高表达导致植株矮化、叶变窄、气孔密度降低；同时我们检测到miR396能延茎轴方向向上传递,暗示miR396可能参与依赖韧皮部运输的信号传导。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-11
第一章 前言  11-23
  1.1 植物microRNAs鉴定  11-12
  1.2 植物microRNAs的发生及其作用机制  12-16
    1.2.1 植物microRNAs的发生  12-15
    1.2.2 microRNAs的作用机制  15-16
  1.3. 植物microRNAs的调节作用  16-21
    1.3.2 植物microRNA对生长发育的调节作用  16-18
    1.3.3 植物microRNA对逆境胁迫应答的调节作用  18-21
  1.4 拟南芥中的miR396及其靶基因  21-23
第二章 材料与方法  23-31
  2.1 实验材料  23-24
    2.1.1 植物材料  23
    2.1.2 菌株与质粒  23-24
  2.2 所用试剂  24
  2.3 实验方法  24-31
    2.3.1 质粒构建  24
    2.3.2 玻璃珠法胶回收DNA  24-25
    2.3.4 质粒DNA转化大肠杆菌  25
    2.3.5 Mini质粒DNA提取  25-26
    2.3.6 2×CTAB法提取总DNA  26
    2.3.7 农杆菌感受态制备及转化  26
    2.3.8 LiCl法大量提取RNA  26-27
    2.3.9 Trizol小量提取RNA  27
    2.3.10 Northern杂交  27-29
    2.3.11 MicroRNA杂交(Northern杂交)  29-31
第三章 结果  31-49
  3.1 miR396的保守性  31-32
  3.2 高表达转基因植株获得  32-34
  3.3 窄叶表型  34-35
  3.4 窄叶机制  35-38
  3.5 其他表型  38-41
    3.5.1 顶端优势减弱侧枝数目增加  38
    3.5.2 叶片数增多  38-39
    3.5.3 花器官发育异常  39-41
  3.6 抗旱性  41-43
    3.6.1 干旱处理诱导烟草miR396表达  41-42
    3.6.2 高表达miR396提高烟草抗旱性  42-43
  3.7 抗旱机制  43-46
    3.7.1 高表达miR396转基因烟草保水能力增强  43-44
    3.7.2 高表达miR396转基因烟草叶面气孔减少  44-46
  3.8 小分子传递  46-49
第四章　讨论  49-52
  4.1 高表达拟南芥miR396的方法对于研究miR396在烟草中的功能切实可行  49
  4.2 miR396在烟草中负调控NtGRF-like  49-50
  4.3 miR396在烟草中调节花器官发育  50-51
  4.4 小分子传递  51-52
参考文献  52-63
论文目录  63-64
致谢  64-65

相似论文

  1. 干旱胁迫对桂花生长及生理生态的影响,S685.13
  2. ABA和H2O2对干旱高温复合胁迫诱导的玉米sHSPs和抗氧化防护酶的作用,S513
  3. 逐渐干旱对牡丹实生苗生理指标的影响和牡丹GA20-氧化酶基因的克隆与序列分析,S685.11
  4. 聚乙二醇模拟干旱胁迫对黄/红麻种子萌发及茎段扦插的效应,S563.5
  5. 岷江上游山地森林/干旱河谷交错带植被恢复对土壤固氮菌的影响,S714
  6. 乌鲁木齐周边几种野生灌木对干旱和盐胁迫的响应,S718.4
  7. 气候变化背景下大豆幼苗对土壤干旱和高温的生理生态响应,S565.1
  8. 鹰嘴豆热激转录因子CarHSFB2的克隆与功能验证,Q943.2
  9. 岷江上游—干旱河谷区土壤养分季节动态及其对海拔梯度的响应,S714.2
  10. 一株微生物胞外多糖产生菌的研究及应用,TQ929.2
  11. 辽西风沙半干旱地区生态修复效果评价及关键配套技术研究,X171.4
  12. 干旱半干旱地区煤矿开采生态影响研究,X820.3
  13. 荒漠齿肋赤藓抗旱基因ScALDH21、Sc288对干旱胁迫的响应,Q943.2
  14. 干旱胁迫对5个树种生理和叶片超微结构影响,Q945.78
  15. Meta-elliptical copulas函数在干旱分析中的应用研究,P333
  16. 伊犁河流域干旱土的形成及肥力特征,S158
  17. 干旱对农业影响评估与应对干旱的作物布局调整对策,S423
  18. 辽宁省农业干旱风险评价,S423
  19. 土壤干旱胁迫下4种不同基因型小麦脱水素蛋白表达的研究,S512.1
  20. 小麦根际具有ACC脱氨酶活性细菌菌株的分离、鉴定及接种效应的研究,S512.1

中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 烟草（菸草）
© 2012 www.xueweilunwen.com