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多倍体构建及基因组重排对提高酿酒酵母乙醇产量的研究

作　者: 丁文涛
导　师: 马平生
学　校: 天津大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 酿酒酵母 乙醇 多倍体 基因组重排
分类号: TQ223.122
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 46次
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内容摘要


随着人们对矿物燃料造成的环境负面影响认识的加深,以及对石油资源日趋枯竭的担忧,开发可再生燃料已成为当今发展趋势。燃料乙醇作为一种清洁可再生的生物能源已在许多国家生产和使用。目前燃料乙醇的生产主要是通过酿酒酵母对淀粉质或糖质原料的发酵来实现。浓醪发酵是一种在高糖浓度下的新兴乙醇发酵方法,提高了乙醇浓度和发酵的速度,从而节约了能耗,提高了设备利用率。但浓醪发酵条件下高渗透压和高乙醇浓度对菌株的生长和发酵不利,因而提高菌株在该条件下的发酵能力很有意义。本研究从工业菌株CN1出发,使用两种方法对其改造来提高浓醪发酵条件下的发酵能力:一是构建多倍体菌株并考察不同染色体组倍数的酿酒酵母系列菌株发酵能力差异;二是使用EMS诱变及基因组重排的方法筛选发酵能力提高的菌株。用质粒YCplac33-GHK转化二倍体工业菌株CN1,并诱导该质粒的HO基因表达,得到交配型为MATa/a和MATα/α的双倍体菌株。对CN1拆孢得到交配型为MATa和MATα单倍体菌株。使不同交配型酵母发生融合,可得到三倍体和四倍体菌株。发酵实验显示,尽管多倍体菌株的乙醇耐受力提高,但耗糖速度和乙醇产量低于二倍体。本研究在确定甲基磺酸乙酯(EMS)最佳诱变剂量的基础上,对双倍体酵母菌株CN1进行诱变。并利用酵母的生孢和融合,实现基因的分离和重排。通过富集、初筛和复筛工作得到了浓醪发酵结束时残糖浓度降低21%、乙醇产量提高0.8%、乙醇转化率提高0.5%且乙醇耐受力有所提高的菌株WTE1;和残糖浓度降低61%、乙醇产量提高1.3%且乙醇转化率提高0.3%的菌株WTE2。研究结果证明:本研究采用的策略是一种有效的酿酒酵母乙醇发酵菌株改造方法。

全文目录


中文摘要  3-4
ABSTRACT  4-8
第一章 文献综述  8-23
  1.1 燃料乙醇的国内外发展状况  8-9
  1.2 发酵法生产乙醇  9-10
  1.3 乙醇发酵菌株研究进展  10-13
    1.3.1 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)  10-11
    1.3.2 运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)  11-12
    1.3.3 大肠埃希氏菌(Escherichia coli)  12
    1.3.4 其他微生物  12-13
  1.4 酵母改造策略  13-14
  1.5 诱变育种  14-17
    1.5.1 突变和诱变剂  15-16
    1.5.2 诱变育种的一般过程  16-17
  1.6 酿酒酵母基因组、交配型及染色体倍数  17-23
    1.6.1 酿酒酵母的基因组  17
    1.6.2 酿酒酵母的交配型  17-21
    1.6.3 多倍体酿酒酵母  21-23
第二章 实验材料及方法  23-41
  2.1 实验材料  23-29
    2.1.1 菌株与质粒  23
    2.1.2 主要仪器  23-24
    2.1.3 主要试剂  24-27
    2.1.4 培养基  27-28
    2.1.5 主要溶液  28-29
  2.2 实验方法  29-35
    2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备与转化  29-30
    2.2.2 小规模提取大肠杆菌质粒法（CTAB法）  30
    2.2.3 酵母染色体的快速分离  30-31
    2.2.4 PCR扩增反应  31
    2.2.5 DNA的限制酶消化  31-32
    2.2.6 DNA的连接反应  32
    2.2.7 DNA的琼脂糖凝胶电泳  32-33
    2.2.8 酵母交配型的验证  33
    2.2.9 不同交配型酵母细胞之间的杂交  33-34
    2.2.10 产孢及四分体孢子拆分  34
    2.2.11 酵母EMS诱变  34
    2.2.12 酵母高效产孢法  34-35
    2.2.13 孢子纯化方法  35
  2.3 发酵过程的准备及主要分析方法  35-41
    2.3.1 发酵培养基制备  35-36
    2.3.2 菌种扩大培养与接种  36
    2.3.3 发酵条件  36-37
    2.3.4 发酵样品的收集及细胞生长状态的测定  37
    2.3.5 DNS法测定还原糖的测定  37-38
    2.3.6 HPLC测定发酵液中组分  38-40
    2.3.7 美兰（次甲基蓝）染色法测定活细胞浓度  40-41
第三章 结果与讨论  41-62
  3.1 多倍体酿酒酵母菌株的构建以及发酵研究  41-53
    3.1.1 由工业菌株双倍体酿酒酵母CN1 出发拆孢子得到单倍体菌株  41-44
    3.1.2 交配型为MATa/a和MATα/α的双倍体酵母菌株的构建  44-46
    3.1.3 多倍体菌株的构建  46-49
    3.1.4 不同染色体组倍数酿酒酵母系列菌株性能比较  49-53
  3.2 使用EMS诱变和基因组重排技术获得高产乙醇酿酒酵母菌株  53-62
    3.2.1 最佳诱变剂剂量的确定  53-54
    3.2.2 突变文库的构建  54
    3.2.3 基因组有性重排  54-56
    3.2.4 基因组重排后优势菌株的富集  56-57
    3.2.5 富集后菌株的初筛  57-59
    3.2.6 复筛  59-62
第四章 总结与展望  62-64
  4.1 工作总结  62
  4.2 工作展望  62-64
参考文献  64-69
致谢  69

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 基本有机化学工业 > 脂肪族化合物（无环化合物）的生产 > 脂肪族醇（醇、羟基化合物）及其衍生物 > 脂肪族醇 > 饱和一元醇 > 乙醇（酒精）
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