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谷胱甘肽发酵条件的优化扩大及其分离纯化

作　者: 史玉敏
导　师: 蔡俊；邱雁临
学　校: 湖北工业大学
专　业: 发酵工程
关键词: 啤酒酵母Y-14 谷胱甘肽发酵罐 D001大孔树脂 SephadexG-10
分类号: TQ464.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

谷胱甘肽(GSH)是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸这三种氨基酸组成的小肽化合物,具有清除自由基、解毒、抑制衰老、抑制艾滋病毒、提高人体免疫力等重要生理功能,在医学、食品、化妆品等领域具有广泛的市场前景。现有GSH生产能力远不能满足市场需求,所以采用GSH高产菌株发酵廉价原料转化为GSH,建立适合工业化分离纯化GSH的方法会带来巨大的社会和经济效益。本文以富含GSH的啤酒酵母Y-14为材料,分别从以下四个方面进行研究: (1)利用Plackett-Burman试验设计、Box-Behnken试验设计法对啤酒酵母Y-14产GSH培养基进行优化,得到的最适培养基配方为:葡萄糖20g/L,酵母膏10g/L,(NH4)2SO4 8g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4 0.15g/L。对优化结果进行验证试验,GSH产量可达到124.77mg/L。(2)利用单因素试验对啤酒酵母Y-14产GSH发酵条件进行研究,结果得到摇瓶最适发酵条件为培养温度30℃、初始pH6.0、摇床转速180rpm、摇瓶装液量30mL/300mL、补料培养基添加时间20h。在此条件下,菌体胞内GSH含量达到31.56mg/g,GSH的产量可达249.2mg/L,较原来提高了102%。(3)利用10L自动发酵罐补料培养啤酒酵母Y-14,①采用恒速流加单一葡萄糖培养基,20h时添加前体氨基酸和ATP的方法,测得GSH的产量在52h时,达到最大值243mg/L。②采用恒速流加全营养培养基,36h时添加补料培养基的方法,测得GSH产量在52h达到最大值520.742mg/L。比较发现,第二批发酵罐培养菌体干重、GSH产量较第一批分别提高了122.5%、114.2%。(4)采用D001大孔树脂粗分离GSH,得到最佳分离条件为:上样pH3.0,浓度为61.4mg/100mL,流速为0.5mL/min,洗杂质用液为无水乙醇,洗脱液为1.5% HCl + 0.3mol/L NaCl,流速为3mL/min。GSH的平均收得率为69.11%,蛋白质去除率为64.8%。然后通过SephadexG-10脱盐纯化GSH,得到最适条件:Φ1.6cm×25cm玻璃层析柱,上样浓度为116.66mg/100mL,上样体积为20mL。结果GSH的平均收得率为96.21%。最后SephadexG-10分级分离纯化GSH,采用Φ1.6cm×50cm玻璃层析柱,最适上样体积为2mL,GSH的平均收得率为99.26%,蛋白质去除率为56.5%。GSH浓缩倍数平均为9.07倍,纯化倍数为8.67倍。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-10
第1章引言  10-20
  1.1 谷胱甘肽概述  10-13
    1.1.1 谷胱甘肽结构和性质  10-12
    1.1.2 谷胱甘肽的生理功能及其应用  12-13
  1.2 发酵法生产谷胱甘肽的国内外研究动态  13-18
  1.3 本研究的意义、目的及内容  18-19
    1.3.1 意义  18
    1.3.2 目的  18-19
    1.3.3 研究内容  19
  1.4 常用研究指标的说明  19-20
第2章啤酒酵母Y-14 发酵GSH 培养基的优化  20-29
  2.1 材料  20-22
    2.1.1 菌种  20
    2.1.2 培养基  20-21
    2.1.3 主要试剂  21
    2.1.4 主要仪器  21-22
  2.2 方法  22-23
    2.2.1 菌株活化  22
    2.2.2 种子摇瓶培养  22
    2.2.3 摇瓶发酵培养  22
    2.2.4 菌种的保藏  22
    2.2.5 DTNB 法检测GSH 含量  22
    2.2.6 试验设计方法  22-23
  2.3 结果与分析  23-28
    2.3.1 显著影响因素的筛选结果  23-25
    2.3.2 Box-Behnken 设计进一步优化培养基试验结果  25-28
  2.4 结论  28-29
第3章啤酒酵母Y-14 产GSH 发酵条件的优化  29-38
  3.1 材料  29-30
    3.1.1 菌种  29
    3.1.2 培养基  29-30
    3.1.3 主要试剂  30
    3.1.4 主要仪器  30
  3.2 方法  30-31
    3.2.1 啤酒酵母Y-14 生长曲线的测定  30
    3.2.2 发酵周期的优选试验  30
    3.2.3 发酵温度的优选试验  30-31
    3.2.4 发酵初始pH 的优选试验  31
    3.2.5 发酵摇床转速的优选试验  31
    3.2.6 发酵摇瓶装液量的优选试验  31
    3.2.7 摇瓶发酵产GSH 的进程试验  31
  3.3 结果与分析  31-37
    3.3.1 啤酒酵母Y-14 生长曲线的绘制  31-32
    3.3.2 发酵周期的优选试验结果  32-33
    3.3.3 发酵温度的优选试验结果  33
    3.3.4 发酵初始pH 值的优选试验结果  33-34
    3.3.5 发酵摇床转速的优选试验结果  34-35
    3.3.6 发酵摇瓶装液量的优选试验结果  35-36
    3.3.7 摇瓶发酵产GSH 进程曲线的绘制  36-37
  3.4 结论  37-38
第4章 10L 自动发酵罐扩大发酵的初探  38-50
  4.1 材料  38-39
    4.1.1 菌种  38
    4.1.2 培养基  38-39
    4.1.3 主要试剂  39
    4.1.4 主要仪器  39
  4.2 方法  39-41
    4.2.1 斜面种子培养  39-40
    4.2.2 一级种子摇瓶培养  40
    4.2.3 二级种子摇瓶培养  40
    4.2.4 发酵罐流加培养试验  40
    4.2.5 分析方法  40-41
  4.3 结果与讨论  41-49
    4.3.1 第一批发酵罐补料培养  41-45
    4.3.2 第二批发酵罐补料培养  45-49
  4.4 结论  49-50
第5章啤酒酵母Y-14 中还原型GSH 的分离纯化  50-66
  5.1 材料  50-51
    5.1.1 菌种  50-51
    5.1.2 主要材料  51
    5.1.3 主要设备  51
  5.2 方法  51-55
    5.2.1 GSH 提取液的制备  51
    5.2.2 检测方法  51
    5.2.3 相关数据的计算公式  51-52
    5.2.4 D001 大孔树脂离子交换柱的试验流程  52
    5.2.5 D001 大孔树脂分离GSH 的研究  52-53
    5.2.6 SephadexG-10 凝胶柱的试验流程  53-54
    5.2.7 SephadexG-10 纯化GSH 的研究  54-55
  5.3 结果与分析  55-65
    5.3.1 D001 大孔树脂分离GSH 的研究结果  55-59
    5.3.2 SephadexG-10 脱盐纯化GSH 的研究结果  59-62
    5.3.3 SephadexG-10 分级分离纯化GSH 的研究结果  62-65
  5.4 结论  65-66
第6章总结与展望  66-68
  6.1 总结  66-67
  6.2 创新点  67
  6.3 展望  67-68
参考文献  68-73
致谢  73-74
附录  74

谷胱甘肽发酵条件的优化扩大及其分离纯化

内容摘要

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