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一种harpin基因在转基因拟南芥中表达及体外使用harpin蛋白诱导植物防卫反应的研究

作　者: 苟振华
导　师: 董汉松
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: Harpin 植物生长抗病性拟南芥蚜虫趋避甜瓜
分类号: S432.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

Harpin是由革兰氏阴性植物病原细菌产生的一类蛋白类激发子,它们的共同特征是：富含甘氨酸,热稳定,对蛋白酶敏感,在寄主植物上产生致病性,在非寄主植物叶片上可以诱导Hypersensitive response (HR)或Hypersensitive cell death (HCD)。当外源使用harpin时,可以诱导多种植物抗病、抗虫、耐旱,并可促进植物生长,但是,对于harpin多重功能的分子机理,目前还不清楚,为深入研究harpin信号在植物体内传导的机制,选取了目前研究较多的由水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv. oryzae的HpaGXoo和蔷薇科植物火疫病的病原细菌Erwinia amylovora产生的HrpNEa作为研究对象,产生了表达HpaGXoo的转基因拟南芥,并测定了转基因拟南芥的抗病防卫反应；同时,为了确定HrpNEa诱导有益表型的广谱性,研究了HrpNEa在甜瓜上诱导蚜虫趋避效应。1.HpaGXoo在拟南芥中转基因表达促进植物生长和抗病性我们将编码HpaGXoo的基因hpaGXoo构建到pBI121双元载体上,通过真空花絮渗透法转入拟南芥,获得表达HpaGXoo的拟南芥(HpaGXoo-expressing Arabidopsis, HEAT1)转基因系。对转基因系进行了以下分子验证：通过PCR方法,确定了hpaGXoo基因稳定整合在拟南芥基因组中；RT-PCR证明了hpaGXoo基因在拟南芥中可以转录；从转基因拟南芥中提取的HpaGXoo蛋白能够在烟草上诱导HR；同时根据SDS-PAGE电泳,明确了转基因拟南芥中表达的HpaGxoo蛋白的大小没有改变(15.6 kD)。这些结果表明,hpaGXoo基因在转基因拟南芥体内可以正常翻译为有活性的、完整的HpaGXoo分子。另外,我们对转基因拟南芥的不同株系进行抗病性实验,选择了具有一定代表性的细菌菌株P. syringae pv. tomato DC3000接种拟南芥,结果发现不同的转基因株系都获得了对该细菌的抗性。同时对防卫反应基因NPR1、PR-1和PR3b的表达进行了RT-PCR测定,发现在转基因株系中,防卫反应相关基因都有一定增强表达。然后trypan blue染色证明所有的转基因株系都没有micro-HR的发生,这种现象与外源喷施拟南芥发生了不同。根据以上结果,我们认为HpaGxoo在拟南芥中转基因表达可以促进拟南芥的生长,诱导抗病防卫基因的表达,增强对细菌的抗病性,但不能诱发micro-HR。另外,是否带有信号肽对hpaGXoo基因在植物体内表达后所诱导的促生长和抗病没有影响。2.HpaGXoo融合蛋白的表达、纯化及抗体制备HpaGxoo同其他harpin一样,在植物上可以诱导产生多种效应,但是对于该蛋白在植物上是如何起作用,在什么部位起作用,目前还不清楚。已有人报道了harpin在植物细胞中的作用部位,但对不同harpin的研究结果不尽相同。为了进一步研究HpaGxoo在植物中的作用部位,我们构建了可用于HpaGXoo蛋白纯化的高效表达载体,原核表达、纯化了融合蛋白,并制备了抗血清。我们利用PCR方法从水稻白叶枯病菌的基因组DNA中扩增得到hpaGXoo基因,连接pET30a(+)载体,该载体上保留了蛋白质纯化所需的His tag编码序列。重组质粒转化宿主菌BL21(DE3)产生表达菌株。表达菌株经IPTG诱导培养,提取蛋白进行SDS-PAGE电泳,产生分子量为21.6 kD大小的组氨酸标记的融合蛋白条带。利用HisTrap HP Kit试剂盒对HpaGXoo融合蛋白进行了纯化,并得到21.6 kD大小的单一条带。该纯化蛋白可以在烟草上引起典型的过敏性反应,我们将纯化的HpaGxoo蛋白免疫家兔,获得了HpaGXoo蛋白的多克隆抗体,间接ELISA方法测定抗血清的效价达到1：16,000以上。同时利用Western blot对蛋白与抗体之间的特异性结合进行了验证,结果表明,不论是粗蛋白还是纯化蛋白在相应的位置上都有很强的杂交信号,而空载体提取物在相应的位置没有任何信号。我们提取了植物中表达的HpaGXoo蛋白,并对其进行了杂交分析,结果表明,转基因植物中表达的HpaGXoo蛋白和原核表达的一样可以和抗血清特异性识别并产生较强的杂交信号,由于该蛋白原核表达融合了his-tag,故比植物中表达的蛋白条带大,因此杂交信号不在一条直线上。3.HrpNEa在甜瓜上诱导韧皮部防卫和蚜虫趋避效应植物韧皮部相关防卫(plant phloem-based defense, PBD)能够抵抗刺吸式昆虫的取食。已知HrpNEa类生物激发子能够激发抗虫信号传导途径,可能参与了韧皮部防卫反应的诱导,但是HrpNEa的这种诱导抗虫性是否在其他植物上有广谱性还没有证实。RT-PCR及化学发光实验结果证明HrpNEa处理后可以增加在韧皮部产生韧皮部相关蛋白的表达及胼胝质的沉积,两者共同构成了PBD反应,并且有利于蚜虫驱避、减少蚜虫在韧皮部的取食活动；对甜瓜野生型和HrpNEa处理的植株蚜虫趋避效应以及蚜虫刺吸电子信号分析,结果表明蚜虫更喜好取食对照植株；此外,HrpNEa处理增加了蚜虫对叶片的试探性的刺吸,而韧皮部取食活动明显降低,说明处理后降低了蚜虫对植株的取食喜好。同时通过统计结果可以看出,HrpNEa处理的植株上的蚜虫繁殖受到一定的影响。胼胝质沉积的化学发光实验也证明HrpNEa处理后降低了蚜虫对植株的取食喜好,增加了韧皮部胼胝质沉积。本文创新点：研究明确了harpin蛋白在植物体内表达所产生的生物学效应；探讨了HrpNEa诱导植物抗虫及对蚜虫取食行为的影响。

全文目录

中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
文献综述  12-26
  第一章 Harpin蛋白在植物上的生物学效应  12-22
    Harpin的分子生物学特征  12-14
    Harpin在植物上的多种效应  14-17
    Harpin在植物细胞上的作用部位  17-22
  第二章植物韧皮部相关防卫对植物抗虫性的影响  22-26
    韧皮部防卫反应和蚜虫趋避  22-23
    植物在抗虫中的引发机制  23-24
    胼胝质的生物学特性及功能  24-26
研究报告  26-64
  第一章 HpaG_(Xoo)转基因表达促进植物生长和抗病性  26-40
    1 材料与方法  28-31
    2 结果与分析  31-36
      转基因拟南芥的产生与鉴定  31-32
      HpaG_(Xoo)转基因表达提高拟南芥的发芽率并促进根的生长  32-33
      HpaG_(Xoo)转基因表达增强拟南芥对DC3000的抗病性  33-34
      HpaG_(Xoo)在转基因拟南芥中诱导防卫反应基因表达  34-35
      转基因拟南芥中表达的HpaG_(Xoo)的活性测定  35-36
      转基因植株不发生过敏性细胞死亡  36
    3 讨论  36-40
  第二章 HpaG_(Xoo)融合蛋白的表达、纯化抗体制备  40-54
    1 材料与方法  41-47
      菌株、质粒和植物材料  42
      HpaG_(Xoo)基因的扩增  42-43
      pET30a(+)∷hpaG_(Xoo)重组表达载体的构建  43-44
      融合蛋白的表达及活性测定  44-45
      融合蛋白的纯化与定量及其活性测定  45-46
      多克隆抗体的制备  46
      Western blot分析  46-47
    2 结果与分析  47-51
    3 讨论  51-54
  第三章 HrpN_(Ea)诱导甜瓜对蚜虫趋避作用  54-64
    1 材料与方法  55-57
    2 结果与分析  57-61
      甜瓜中AtPP2类似蛋白受HrpN_(Ea)诱导表达  57-58
      甜瓜中胼胝质的沉积受到HrpN_(Ea)的诱导  58
      刺探电位检测蚜虫在不同处理的甜瓜上的取食情况  58-60
      HrpN_(Ea)诱导甜瓜对蚜虫的趋避  60-61
    3 讨论  61-64
参考文献  64-70
缩略语  70-72
攻读硕士学位期间发表的论文  72-74
致谢  74

一种harpin基因在转基因拟南芥中表达及体外使用harpin蛋白诱导植物防卫反应的研究

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