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绵羊高繁殖力候选基因LHβ和GnRHR的研究

作　者: 刘源
导　师: 王锋
学　校: 南京农业大学
专　业: 动物遗传育种与繁殖
关键词: PCR-SSCP 绵羊 LHβ基因 GnRHR基因多态性生物信息学
分类号: S826
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

促黄体素(luteinizing hormone, LH)是垂体前叶嗜碱性细胞合成分泌的糖蛋白激素,由α和β两个亚基组成,是促使雌性卵泡成熟和排卵的重要激素。促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone, GnRH)是下丘脑神经内分泌细胞合成的十肽,以脉冲形式释放,刺激LH和FSH的合成与释放,其功能的发挥依赖于促性腺激素释放激素受体(gonadotropin releasing hormone receptor, GnRHR)的作用。本试验采用PCR-SSCP技术,将LHp基因和GnRH基因作为目的基因,对湖羊、无角陶赛特羊、特克赛尔羊以及哈萨克羊共307只个体进行多态性检测,分析绵羊LHp基因和GnRH基因第一、二外显子的遗传多样性,并分析了各多态位点与绵羊生产繁殖性状之间的关系,探讨调控绵羊繁殖力的基因位点,为湖羊的选育和保种提供理论基础。在此基础上,进一步利用生物信息学软件对LHβ基因和GnRH基因的氨基酸组成、序列的特征进行了分析,并进行了结构和功能的预测。研究结果如下：1.绵羊LHp基因和GnRH基因第一、第二外显子的PCR-SSCP分析对8个扩增片断进行PCR-SSCP分析(LHp,引物1-6；GnRH,引物7-8),在其中的5个扩增片断上发现了突变。其中,引物2扩增片段中发现6种基因型(AA、AB、AC、BB、BC、BD)；引物4扩增片段中发现2种基因型(EE,EF)；引物5扩增片段中发现5种基因型(GG,GH,HH,GI，GJ)；引物7扩增片段中发现3种基因型(AA,AB,CC)；引物8扩增片段中发现3种基因型(DD,DE,EE)。测序结果表明：LHβ5′调控区发现4个多态性位点(286T→C、424A→G、439T→c、705G→A),在第二外显子区发现2个多态性位点(1042bpC→G、1136C→T),其中1042bp处突变导致了甘氨酸→丙氨酸的改变。GnRH第一外显子5’非翻译区发生3处碱基突变(552T→G、653C→G、654G→A)；在第二外显子区发生1处碱基突变(230G→C),导致了精氨酸→丝氨酸的改变。2.LHβ基因和GnRH基因群体遗传学分析及与绵羊生产繁殖性能的关系群体遗传学分析表明：对于片断2,A为优势等位基因,在湖羊和无角陶赛特羊中发现除BC基因型以外的5种基因型；特克赛尔羊中发现BC基因型,但未发现BB、BD基因型,哈萨克羊只存在AA基因型。对于片段4,E为优势等位基因,除哈萨克羊只存在EE基因型外,湖羊、无角陶赛特和特克赛尔羊均存在EE和EF2种基因型。引物5在湖羊中发现5种基因型(GG、GH、GI、GJ、HH),G为优势等位基因,在无角陶赛特羊中发现2种基因型(GG和GI),特克赛尔羊和单胎哈萨克羊只存在GG基因型。对于引物7扩增片段,A为优势等位基因,只在哈萨克羊中检测到CC基因型,但没有发现AB基因型。对于引物8扩增片段,在4个绵羊群体中,D为优势等位基因,在湖羊中同时存在DD、DE、EE三种基因型,哈萨克羊中没有发现EE基因,无角陶赛特和特克赛尔羊中没有发现EE和DE基因型。群体平衡检测发现,引物2扩增片段中,湖羊和无角陶赛特羊的x2值达到显著水平,偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。在引物5扩增片段中,特克赛尔羊的x2值达到显著水平,偏离Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)。各多态位点与湖羊产羔数的最小二乘分析表明：对于片断2,AB基因型产羔数最小二乘均值比AA基因型多0.45只(P<0.05)；对于片断5,GJ基因型产羔数最小二乘均值比GG基因型多1.83只(P<0.05)；引物2和引物5基因突变与产羔数成正相关,对于片断4、7、8,产羔数最小二乘均值在各基因型间没有显著差异.3.绵羊LHβ基因和GnRH基因的生物信息学分析运用生物信息学软件对LHβ基因和GnRH基因的氨基酸组成、亚细胞定位以及氨基酸序列的特征进行了分析,并进行了结构和功能的预测。研究发现LHβ基因5’调控区突变(439,T→C；705,G→A)和GnRHR基因5’调控区突变(552,T→G)突变引起转录因子结合位点的变化；LHp基因和GnRH基因编码区部分突变引起氨基酸改变并引起蛋白质二级结构发生了变化。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
文献综述部分  11-19
  第一章哺乳动物LHβ和GnRHR的研究进展  11-19
    1 LHβ的研究进展  11-15
      1.1 LHβ的定位  11
      1.2 LHβ的基因结构  11-12
      1.3 LHβ的转录调控  12
      1.4 LHβ的生理功能  12-15
    2 GnRHR的研究进展  15-19
      2.1 GnRHR的基因结构和定位  15
      2.2 GnRHR的表达特征  15-16
      2.3 GnRHR的生理功能  16
      2.4 GnRHR基因的信号转导和转录调控  16
      2.5 GnRHR与繁殖性能之间的关系  16-19
试验研究部分  19-57
  第二章 LHβ基因和GnRHR基因的PCR-SSCP分析  19-35
    1 材料与方法  19-24
      1.1 样本采集及生长指标的记录  19
      1.2 试验药品  19-20
      1.3 仪器设备  20
      1.4 DNA的提取  20-21
      1.5 DNA纯度的检测  21
      1.6 引物设计  21
      1.7 PCR扩增  21-22
      1.8 SSCP分析  22-24
      1.9 测序分析  24
      1.10 统计分析  24
    2 结果与分析  24-28
      2.1 PCR扩增  24-25
      2.2 SSCP结果分析  25-27
      2.3 纯合个体测序分析  27-28
    3 讨论  28-35
      3.1 试验材料的选择  28-29
      3.2 DNA的提取及保存  29-30
      3.3 最佳PCR条件的建立  30-32
      3.4 影响PCR-SSCP检测的因素  32-34
      3.5 测序结果分析  34-35
  第三章 LHβ基因和GnRHR基因群体遗传学分析及与四个品种绵羊生产繁殖性能的关系  35-49
    1 统计分析方法  35-38
      1.1 基因频率  35
      1.2 基因型频率  35-36
      1.3 遗传杂合度  36
      1.4 有效等位基因数  36
      1.5 多态信息含量值的计算  36-37
      1.6 基因位点Hardy-Weinberg平衡状态的检验  37
      1.7 LHβ基因和GnRHR基因各多态位点与绵羊生产繁殖性状的关系  37
      1.8 遗传距离及聚类分析  37-38
    2 结果与分析  38-46
      2.1 基因频率与基因型频率  38
      2.2 不同绵羊品种纯合度、杂合度、有效等位基因数及多态信息含量  38-40
      2.3 Hardy-Weinberg平衡的检验结果  40-41
      2.4 LHβ和GnRHR基因各多态位点与绵羊生产繁殖性状的相关性分析  41-46
      2.5 遗传距离和聚类分析  46
    3 讨论  46-49
  第四章绵羊LHβ和GnRHR基因的生物信息学分析  49-57
    1 方法与材料  49-50
      1.1 软件工具  49
      1.2 核酸序列分析  49-50
      1.3 基因酶切位点分析  50
      1.4 氨基酸组成分析  50
      1.5 亚细胞定位  50
      1.6 二级结构预测  50
    2 结果与分析  50-55
      2.1 核酸序列分析  50
      2.2 酶切位点析  50-52
      2.3 氨基酸组成分析  52-53
      2.4 亚细胞定位分析  53
      2.5 蛋白折叠及二级结构预测  53-55
    3 讨论  55-57
全文结论  57-59
参考文献  59-65
附录  65-67
致谢  67

绵羊高繁殖力候选基因LHβ和GnRHR的研究

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