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猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测方法的建立与应用

作　者: 陈海涛
导　师: 吴斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 日本乙型脑炎病毒囊膜糖蛋白 ELISA 抗体检测
分类号: S858.28
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

日本乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)简称乙脑,是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(JE virus,JEV)引起的人畜共患性传染病。猪是本病的扩散宿主,主要引起猪的繁殖障碍性疾病。猪群中高水平的抗体有助于抵抗病毒传播,这在规模化养猪场有重要意义,也有重要的公共卫生学意义。因此,建立和完善乙型脑炎抗体水平的评价方法至关重要。本课题通过对比不同的ELISA方法,选择建立基于地鼠原代肾细胞病毒抗原的ELISA方法,主要包括以下三方面研究:1.病毒抗原的制备以及原核表达产物抗原的制备首先,将金黄地鼠原代肾细胞以及BHK-21细胞用于乙脑病毒(SA14-14-2株)的增殖,经硫酸铵沉淀法纯化病毒,作为抗原。同时,将病毒在7日龄鸡胚中增殖,收取病毒尿囊液并使用丙酮沉淀法制备病毒抗原。另外,采用原核系统表达乙脑病毒囊膜糖蛋白基因(E基因),提纯表达的E蛋白包涵体作为蛋白抗原。2.三种不同抗原包被的ELISA方法与康柏德ELISA试剂盒的比较以康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒为标准,同时用以上三种抗原建立的ELISA方法检测72份猪血清。原代细胞源病毒抗原包被间接ELISA方法、鸡胚源病毒抗原包被的间接ELISA方法、E蛋白抗原包被的间接ELISA方法与标准试剂盒的符合率分别为82%、66.6%、58.3%。确定用原代肾细胞源病毒抗原用作包被抗原,用于猪乙脑ELISA抗体试剂盒的开发。3.地鼠原代肾细胞源病毒抗原作为包被抗原的ELISA方法研究方阵滴定确定该ELISA方法抗原的最佳包被浓度为1:3200,即4.5ug/mL,血清稀释液(正常BHK-21细胞悬液作为血清稀释液母液)最佳使用浓度为1:320,血清稀释度固定为1:100。检测115份乙脑抗体阴性血清,计算得该1;份阴性血清平均值((?))为0.155,标准差(SD)为0.045,确定阴阳性临界点((?)+3SD)为0.29。以该方法检测猪伪狂犬病、猪瘟、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征、弓形体、副猪嗜血杆菌、猪链球菌、猪支气管败血波氏杆菌的标准阳性血清,进行特异性试验,结果均为阴性。14份猪血清的重复试验,批内重复变异系数在0.16%～8.53%之间,变异系数(CV)＜5%;批间重复变异系数在0.63%～17.2%之间,变异系数(CV)＜5%。保存期试验表明,建立的试剂盒在37~C该方法可保存3天,在4℃可以保存4个月左右。该方法与康柏德猪乙脑ELISA抗体检测试剂盒的阳性符合率为84.6%,阴性符合率为77%,总符合率为82%。利用所建立ELISA方法检测湖北三个规模化猪场临床送检血清673份,共检出阳性血清108份,阳性率为16%。

猪乙型脑炎病毒ELISA抗体检测方法的建立与应用

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