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大豆多粒荚特异材料BAC文库的构建

作　者: 许靖曼
导　师: 周新安
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: BAC文库大豆多粒荚家系每荚粒数
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

大豆是我国主要粮油作物之一,但因单产较低,优质大豆所占比例少,种植效益不高,导致种植面积逐年下降,进口大豆数量逐年增加,大豆产业形式严峻。构成大豆产量的因素包括单株荚数、单株粒数、每荚粒数、百粒重等。产量性状作为一种数量性状,相关的基因位点较多。其中每荚粒数具有较高的遗传力,对提高大豆产量的贡献较大,因此发掘与每荚粒数相关的基因有可能是提高单株产量的一条有效途径。本研究在每荚粒数相关QTL。定位研究基础上,利用重组自交系群体中多粒荚家系构建BAC文库,为每荚粒数相关基因的克隆建立基础。本实验研究结果说明,在进行大片段DNA制备时,幼嫩叶片更适合于大豆基因组片段DNA的提取,且都集中在400kb以上,小片段DNA很少,次级产物较少,基本上没有蛋白质和细胞质DNA污染,可得到浓度适当、降解较少的DNA琼脂糖包埋块。通过在一定酶切时间内改变内切酶的浓度,确定了大豆基因组大片段DNA的最佳酶切酶量为3.0U。通过回收得到浓度、大小均合适的核DNA酶切片段,建立了高效的大豆大片段连接体系,在载体与大片段比例为1：4.5时,连接效率最高。本试验还改进了Peterson等人的脱盐方法,提高了转化效率,得到了更多的转化子。本试验得到的BAC文库包含了54912个克隆。随机挑取110个克隆进行检测,结果显示,插入片段介于50-200kb,平均大小为125kb,经统计发现70%的BAC插入片段在100kb以上。剔出空载率部分,该BAC文库包含的克隆总量大约为大豆单倍体基因组的5.54倍,筛选到任何一个基因的概率为99.98%,结果说明构建的大豆文库覆盖率较高,克隆数目较大,插入片段较大。随机挑选4个BAC克隆经过100代繁殖后,没有出现丢失或变异,说明本文库的BAC克隆较为稳定,至少可以保存100代。本文库的单倍体基因组覆盖程度、克隆插入片段大小和BAC克隆的稳定性等方面,均达到了国际上对文库构建的要求。本研究首次构建了针对大豆产量构成性状的BAC文库,与已有大豆BAC文库相比,虽然本文库克隆总量不是特别大,但是平均插入片段更大,更有利于图位克隆。本文库既可作为每荚粒数相关基因克隆的实物平台,也可在克隆大豆重要的功能基因、基因染色体物理定位、基因启动子分离与分析等方面发挥重要作用。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-13
第一章文献综述  13-27
  1.1 前言  13-15
  1.2 大豆育种的新趋势  15-16
    1.2.1 基因组学辅助育种  15
    1.2.2 转基因育种技术  15-16
  1.3 大片段基因文库的研究进展  16-21
    1.3.1 Cosmid文库  16
    1.3.2 酵母人工染色体文库(YAC)  16-17
    1.3.3 细菌人工染色体文库(BAC)  17-18
    1.3.4 P1噬菌体衍生人工染色体文库(PAC)  18-19
    1.3.5 植物人工染色体  19
    1.3.6 双元细菌人工染色体(BIBAC)  19-20
    1.3.7 可转化人工染色体文库(TAC)  20-21
  1.4 BAC文库的构建步骤  21-22
    1.4.1 BAC载体的制备  21
    1.4.2 HWM DNA制备  21
    1.4.3 部分酶切最佳酶量的确定  21
    1.4.4 BAC文库的构建  21-22
    1.4.5 BAC文库的检测鉴定  22
  1.5 BAC文库的应用  22-25
    1.5.1 基因的图位克隆  22-23
    1.5.2 基因组物理图谱构建及基因组测序  23
    1.5.3 BAC转基因技术  23-24
    1.5.4 比较基因组学  24
    1.5.5 BAC-FISH  24
    1.5.6 构建大片段文库的意义  24-25
  1.6 本研究的目的及意义  25-27
第二章材料与方法  27-38
  2.1 材料与方法  27-29
    2.1.1 供试材料  27
    2.1.2 菌株来源  27
    2.1.3 载体来源  27
    2.1.4 所用主要试剂  27-28
    2.1.5 所用主要仪器  28-29
  2.2 方法  29-38
    2.2.1 BAC载体的获得  29
    2.2.2 大片段DNA的制备  29-30
    2.2.3 部分酶切最佳酶量的确定  30-31
    2.2.4 部分酶切  31-34
    2.2.5 DNA大片段与载体的连接与转化  34-37
    2.2.6 BAC文库的鉴定  37-38
第三章结果与分析  38-44
  3.1 大片段DNA的制备  38-39
  3.2 部分酶切最佳酶量的确定  39
  3.3 部分酶切  39-41
  3.4 DNA大片段与载体的连接与转化  41-42
  3.5 BAC文库的鉴定  42-44
    3.5.1 BAC文库插入片段大小的检测  42-43
    3.5.2 BAC稳定性检测  43-44
第四章讨论  44-48
  4.1 与已有大豆BAC文库的比较  44
  4.2 大豆BAC文库构建的关键环节  44-46
  4.3 未来研究方向  46-48
    4.3.1 文库的筛选  46-47
    4.3.2 每荚粒数基因的克隆  47-48
参考文献  48-53
致谢  53-54
附录  54-59
作者简历  59

大豆多粒荚特异材料BAC文库的构建

内容摘要

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