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番茄LeDREB1转录因子基因在转基因拟南芥中的功能分析

作　者: 王迎波
导　师: 程宪国
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: LeDREB1 转录因子转基因拟南芥 RT-PCR
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

本实验室利用酵母单杂交技术从番茄(Solanum lycopersicum)的cDNA文库中筛选得到了一个新基因LeDREB1,具有900bp的cDNA开放阅读框序列,编码300个氨基酸,具有一个由58个氨基酸组成的AP2/EREBP保守域,在N末端和C末端分别有一个核定位信号区和转录激活区,类似于DREB转录因子。在实验室前期工作基础上,将LeDREB1基因的全长编码序列成功构建到了由35S启动子驱动的植物表达载体和RNA干扰载体上,借助优化的floral-dip法,转化拟南芥,利用潮霉素抗性筛选,PCR扩增以及GUS染色检测,获得9株阳性苗。进一步筛选分离比接近3:1,外源基因可能为单拷贝插入的株系,已得到2个纯合株系。在携带目的基因的pCAMBIA 1304载体的拟南芥幼苗中,GUS基因在拟南芥的主根、侧根、胚轴部位大量表达,子叶中表达较弱。为进一步研究LeDREB1的功能,对野生型和转基因型植株干旱和高盐胁迫处理。观测分析结果表明,干旱和盐胁迫处理后转基因植株的长势明显好于野生型植株,转基因植株含水量显著高于野生型;干旱和盐胁迫导致野生型和转基因型植株丙二醛含量升高,但野生型植株的丙二醛含量增加量要远远高于转基因植株;转基因型可溶性糖和脯氨酸含量显著高于野生型。可能是目的基因LeDREB1的插入导致了转基因拟南芥的抗逆性明显高于野生型。转基因植株的RT-PCR分析表明,抗逆基因Kin1和cor6.6基因的表达量随着胁迫处理时间的延长而增加。高盐处理1h时Kin1和cor6.6基因的表达量达到峰值;低温胁迫处理3h时Kin1和cor6.6基因的表达量达到峰值,并持续保持较高的表达量。可见,在高盐和低温逆境条件下,转录因子LeDREB1能够调控下游抗逆基因的表达,并且更容易受到低温的诱导表达。

全文目录

摘要  6-7
Abstract  7-12
第一章文献综述  12-24
  1.1 逆境胁迫下植物的应答机制  12-19
    1.1.1 干旱胁迫下植物的应答特征  12-17
    1.1.2 盐胁迫下植物的应答特征  17-19
  1.2 植物转录因子研究进展  19-23
    1.2.1 转录因子特征  19-20
    1.2.2 植物抗逆相关转录因子  20-21
    1.2.3 DREB 类转录因子研究进展  21-23
  1.3 立题目的意义  23
  1.4 技术路线  23-24
第二章载体构建及农杆菌转化  24-37
  2.1 材料  24
    2.1.1 实验材料  24
    2.1.2 酶及试剂  24
  2.2 常用溶液配制和主要仪器  24
    2.2.1 培养基的配制  24
    2.2.2 主要仪器设备  24
  2.3 表达载体构建  24-28
    2.3.1 E.coli.感受态细胞的制备  25
    2.3.2 重组质粒的转化  25
    2.3.3 E.coli.质粒的提取  25
    2.3.4 中间载体构建  25-26
    2.3.5 重组表达载体构建  26
    2.3.6 阳性菌株的鉴定  26-27
    2.3.7 阳性农杆菌菌株鉴定  27-28
  2.4 RNA 干扰载体的构建  28-29
    2.4.1 E.coli.感受态细胞的制备  28
    2.4.2 重组质粒的转化  28
    2.4.3 E.coli.质粒的提取  28
    2.4.4 中间干扰载体pRNAi1017 构建  28-29
    2.4.5 干扰载体构建  29
  2.5 结果与分析  29-37
    2.5.1 目的基因序列分析  29-32
    2.5.2 植物表达载体的构建  32-34
    2.5.3 阳性农杆菌检测  34
    2.5.4 植物干扰载体的构建  34-37
第三章拟南芥转化及其鉴定  37-43
  3.1 前言  37
  3.2 材料  37
    3.2.1 实验材料  37
    3.2.2 常规试剂  37
  3.3 常用试剂配制和主要仪器  37-38
    3.3.1 培养基的配制  37
    3.3.2 一般溶液的配制  37
    3.3.3 主要仪器设备  37-38
  3.4 实验方法  38-40
    3.4.1 Floral-dip 法转化拟南芥植株  38-39
    3.4.2 转基因拟南芥植株的筛选及鉴定  39-40
  3.5 结果与分析  40-43
    3.5.1 转基因拟南芥植株筛选  40-41
    3.5.2 转基因阳性株PCR 检测  41
    3.5.3 转基因植株GUS 染色分析  41-43
第四章转基因拟南芥表型及其生理指标分析  43-54
  4.1 前言  43
  4.2 材料  43
  4.3 溶液配制和主要仪器设备  43
    4.3.1 一般溶液配制  43
    4.3.2 仪器  43
  4.4 实验方法  43-46
    4.4.1 拟南芥材料的处理  43-44
    4.4.2 逆境胁迫条件下生理指标测定  44
    4.4.3 转基因拟南芥下游基因表达检测  44-46
  4.5 结果分析  46-54
    4.5.1 干旱、高盐胁迫下拟南芥的表型观测  46-47
    4.5.2 干旱、高盐胁迫下拟南芥植株含水量变化  47-48
    4.5.3 干旱、高盐胁迫下拟南芥植株MDA 含量变化  48-49
    4.5.4 干旱、高盐胁迫下拟南芥植株可溶性糖含量变化  49
    4.5.5 干旱、高盐胁迫下拟南芥植株脯氨酸含量变化  49-50
    4.5.6 转基因拟南芥下游基因表达特征  50-54
第五章讨论  54-56
参考文献  56-62
致谢  62-63
作者简介  63

番茄LeDREB1转录因子基因在转基因拟南芥中的功能分析

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