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磁性纳米基因工程载体细胞转化方法研究

作　者: 李瑶
导　师: 崔海信
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物物理学
关键词: 磁性纳米颗粒 基因工程载体 PK-15细胞 拟南芥原生质体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


本文用磁性纳米颗粒作为基因工程载体进行了动植物细胞转基因的研究,选择了聚乙烯亚胺(PEI)磁性纳米颗粒、氨基硅烷磁性纳米颗粒和壳聚糖磁性纳米颗粒三种磁性纳米材料作为基因工程载体,对它们的形貌特点,在动植物细胞中的转化效果及其影响因素进行了探讨。目前获得的初步结果如下：(1)通过扫描电镜对三种磁性纳米颗粒的形貌进行了表征,三种磁性纳米颗粒均呈球形结构,PEI磁性纳米颗粒粒径为100-200nm,分散良好,而氨基硅烷磁性纳米颗粒和壳聚糖磁性纳米颗粒粒径均在50nm左右,有严重的团聚现象。通过凝胶电泳阻滞实验和结合率分析,证明三种磁性纳米颗粒都能结合DNA,其中PEI磁性纳米颗粒结合DNA的能力较强,氨基硅烷磁性纳米颗粒和壳聚糖磁性纳米颗粒结合DNA的能力相对较弱。进一步通过原子力显微镜和圆二色谱对PEI磁性纳米颗粒与DNA的结合情况进行了分析,显示DNA与PEI磁性纳米颗粒能结合形成紧密的复合物结构。通过DNase I对磁性纳米颗粒与DNA形成的复合物进行酶切,发现PEI磁性纳米颗粒具有保护DNA的能力,而氨基硅烷磁性纳米颗粒与壳聚糖磁性纳米颗粒保护DNA的能力较弱。(2)MTT法检测磁性纳米颗粒对猪肾细胞(PK-15)细胞的毒性,三种磁性纳米颗粒对PK-15细胞毒性作用较低,其中PEI磁性纳米颗粒毒性作用相对最大,氨基硅烷磁性纳米颗粒和壳聚糖磁性纳米颗粒的毒性相对较小,细胞存活率分别在68%,83%和87%以上。磁性纳米颗粒转染PK-15的实验结果表明,PEI磁性纳米颗粒有着很高的转化效率,当PEI磁性纳米颗粒与DNA质量比为1：1时,转染效率最高,为25%,相对于脂质体阳性对照的转化效率更高(10%),荧光更强。而壳聚糖磁性纳米颗粒的转化效率相对较低,在3%左右,氨基硅烷磁性纳米颗粒转染则未见表达。实验证明PEI磁性纳米颗粒对于PK-15细胞使一种良好的基因载体。(3)本论文首次用磁性纳米颗粒作为基因载体携带DNA转化拟南芥原生质体获得了成功的表达。实验发现PEI磁性纳米颗粒对原生质体的毒性作用较大,当磁性纳米颗粒的用量在10μg时,原生质体完好率仅在10%左右,氨基硅烷磁性纳米颗粒和壳聚糖磁性纳米颗粒毒性较小,原生质体完好率分别在74%和81%以上。磁性纳米颗粒转化拟南芥原生质体的实验结果表明,PEI磁性纳米颗粒对拟南芥原生质体具有一定的转化效果,但是转化效率较低,当PEI磁性纳米颗粒与DNA质量比为1：2时,转化效率最高,约为11%,远远低于PEG阳性对照转化效率的65%。而氨基硅烷磁性纳米颗粒和壳聚糖磁性纳米颗粒转化拟南芥原生质体未见GFP的表达。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章 引言  13-20
  1.1 研究背景  13
  1.2 磁性纳米颗粒的种类  13-14
  1.3 磁性纳米基因载体的特点  14-15
    1.3.1 结合DNA的能力  14
    1.3.2 保护DNA的能力  14-15
  1.4 磁性纳米基因载体转染研究现状  15-18
    1.4.1 体外磁性转染研究  15-16
    1.4.2 体内磁性转染研究  16-17
    1.4.3 磁性纳米颗粒转染与其他转化方法结合  17
      1.4.3.1 磁性纳米颗粒与脂质体结合转染  17
      1.4.3.2 磁性纳米颗粒与病毒结合转染  17
    1.4.4 磁性纳米颗粒转染在细胞内的定位和动态过程  17-18
  1.5 本论文研究目的与意义以及研究内容  18-20
    1.5.1 研究目的与意义  18-19
    1.5.2 研究内容  19-20
第二章 磁性纳米基因工程载体的结构与性能表征  20-29
  2.1 材料与仪器  20
    2.1.1 材料  20
    2.1.2 仪器  20
  2.2 实验方法  20-21
    2.2.1 扫描电镜形态观测  20-21
    2.2.2 DNA结合实验  21
    2.2.3 DNA保护实验  21
  2.3 结果分析  21-27
    2.3.1 扫描电镜形态观察  21-22
    2.3.2 DNA结合实验  22-27
    2.3.3 DNA保护实验  27
  2.4 本章小结  27-29
第三章 磁性纳米基因工程载体转染动物细胞  29-36
  3.1 材料和仪器  29
    3.1.1 材料  29
    3.1.2 仪器  29
  3.2 实验方法  29-30
    3.2.1 磁性纳米基因工程载体的构建  29-30
    3.2.2 PK-15细胞系的培养  30
    3.2.3 PK-15细胞毒性实验  30
    3.2.4 PK-15细胞转染实验  30
  3.3 结果分析  30-34
    3.3.1 磁性纳米颗粒对PK-15细胞的毒性作用  30-32
    3.3.2 PK-15细胞转染效率评价  32-34
  3.4 本章小结  34-36
第四章 磁性纳米基因工程载体转化植物细胞  36-45
  4.1 材料和仪器  36-37
    4.1.1 材料  36
    4.1.2 仪器  36-37
  4.2 实验方法  37-38
    4.2.1 磁性纳米基因工程载体的构建  37
    4.2.2 拟南芥原生质体的制备  37
    4.2.3 拟南芥原生质体毒性实验  37-38
    4.2.4 拟南芥原生质体转化实验  38
  4.3 结果分析  38-43
    4.3.1 磁性纳米颗粒对拟南芥原生质体的毒性分析  38-39
    4.3.2 拟南芥原生质体转化效率评价  39-43
  4.4 本章小结  43-45
第五章 结论  45-48
  5.1 本工作的研究结论  45-46
    5.1.1 磁性纳米颗粒的作为基因工程载体的结构和特性考察  45
    5.1.2 磁性纳米颗粒转染动物细胞  45-46
    5.1.3 磁性纳米颗粒转化植物细胞  46
  5.2 讨论和展望  46-48
参考文献  48-53
致谢  53-54
作者简历  54

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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