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低强度脉冲超声优化组织工程化软骨的构建及其修复关节软骨缺损的实验研究

作　者: 董睿
导　师: 马勇
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中医骨伤科学
关键词: 低强度脉冲超声组织工程化软骨软骨缺损修复
分类号: R318.08
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景与目的：随着交通的日益发达与体育运动的不断普及,关节软骨损伤的发病率呈递增趋势,加之人口老龄化产生的大量骨关节炎的患者,使得软骨缺损修复一度成为临床及相关基础研究中亟待解决的难题之一,目前经典的全层透明软骨修复方法大部分不能达到预期的疗效,因此,研究人员和医生必须找出一个可靠的方法。近年来,组织工程技术的出现为人们带来了新的希望。本研究选取藻酸钙作为载体、软骨细胞作为种子细胞,在低强度脉冲超声(Low-intensive Pulsed Ultrasound, LIPUS)的干预下构建组织工程化软骨,并探讨其对兔膝关节软骨缺损的修复作用,为治疗软骨缺损提供一个新思路。方法：1、选取2周龄的新西兰大白兔,无菌操作下切取双膝关节软骨,采用机械法联合酶一步消化法分离软骨细胞并进行培养,对培养的软骨细胞进行生物学鉴定(甲苯胺蓝染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色)。2、将软骨细胞与海藻酸钠混合制成细胞悬液,调整细胞密度为5×106/ml,加入足量的Cacl2,混匀后放入特定的模型中制作成特定形状的软骨细胞／藻酸钙凝胶复合物。3、将制备好的凝胶分组施加LIPUS刺激,空白组(无超声)；低强度超声组(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50);中强度超声组(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:75mv, Cycle:50);高强度超声组(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:100mv, Cycle:50),干预三天后通过CCK-8及免疫组化检测细胞的增殖情况、Ⅱ型胶原的表达量,从而筛选出最佳的超声参数。4、选取27只28～35周龄的新西兰大白兔,采用适当的方法制造兔股骨髁间窝直径约为3mm,深3mm的圆柱形软骨缺损模型,将兔子分为模型组(Control)、普通藻酸钙组(LIPUS-)及超声藻酸钙组(LIPUS+)。在藻酸钙组及超声藻酸钙组中分别填入对应的凝胶,分别于4、8、12周处死兔子,切取股骨远端进行大体观察及病理学观察,对组织切片进行HE染色、番红O染色、Ⅱ型胶原免疫组化染色,并进行wakitani评分。结果：1、通过机械法联合酶消化法可顺利的分离出软骨细胞,一定的培养条件下,培养至2-3代的细胞生长能力强、细胞外基质分泌旺盛,可作为种子细胞。2、软骨细胞可较好的在藻酸钙中生长、增殖,低、中强度组的超声能够促进软骨细胞在三维培养环境下的生长及Ⅱ型胶原的表达,低强度组超声(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50)的促进作用更为明显,而高强度组的LIPUS则抑制了细胞的生长及Ⅱ型胶原的表达。3、第4、8、12周时大体观察及组织学观察提示LIPUS-及LIPUS+的缺损区为透明软骨样组织,而Control则多为纤维样软骨组织,同一时期的LIPUS+修复效果较LIPUS-好。各组的wakitani组织学评分随时间推移而呈现递减趋势,4周时LIPUS+与Control相比有明显差异(P<0.01),LIPUS-组与Control比具有统计学差异(P小于0.05),但LIPUS+与LIPUS-相比无统计学差异(P>0.05),8、12周时两治疗组与Control相比均有明显差异(P<0.01),两治疗组间相比具有统计学差异(P<0.05)。结论：1、利用机械法联合酶消化法能获得大量生物活性强的软骨细胞。2、采用本实验中的方法可制备出符合实验需求的、具有特定形状的软骨细胞／藻酸钙凝胶复合物。一定强度的超声(F0:1MHZ, PRF:1kHZ, Amp:50mv, Cycle:50)能够优化组织工程化软骨的构建。3、软骨细胞／藻酸钙凝胶复合物及LIPUS优化的凝胶复合物均可通过促进软骨缺损修复区的软骨细胞增殖、Ⅱ型胶原等细胞外基质的分泌、降低wakitani评分从而起到修复软骨缺损的作用,相比较而言,LIPUS优化的凝胶复合物修复软骨缺损的效果更为显著。

全文目录

中文摘要  8-10
Abstract  10-12
英汉缩略语名词对照  12-13
前言  13-15
第一部分兔膝关节软骨细胞的原代培养及鉴定  15-23
  1 实验目的  15
  2 实验材料  15-16
    2.1 实验动物  15
    2.2 主要实验器械  15
    2.3 实验耗材与仪器  15
    2.4 主要试剂及药物  15-16
    2.5 主要试剂的配制  16
  3 实验方法及步骤  16-18
    3.1 软骨细胞的体外分离及培养  16-17
    3.2 软骨细胞的传代培养  17
    3.3 软骨细胞的冻存  17
    3.4 软骨细胞形态学观察及功能学特性的鉴定  17-18
      3.4.1 软骨细胞的镜下观察  17
      3.4.2 细胞爬片的制备  17-18
      3.4.3 甲苯胺蓝染色  18
      3.4.4 Ⅱ型胶原免疫组化染色  18
  4 结果  18-19
    4.1 倒置显微镜下观察  18-19
    4.2 软骨细胞功能学特性的鉴定  19
      4.2.1 甲苯胺蓝染色  19
      4.2.2 Ⅱ型胶原免疫组织化学  19
  5 讨论  19-20
    5.1 关节软骨缺损修复的种子细胞  19-20
    5.2 软骨细胞的分离方法  20
    5.3 软骨细胞的体外培养  20
  6 结论  20-21
  附图  21-23
第二部分软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物的配制及优化凝胶复合物的最佳超声参数筛选  23-33
  1 实验目的  23
  2 实验材料  23-24
    2.1 种子细胞  23
    2.2 主要实验器械  23
    2.3 实验耗材与仪器  23
    2.4 主要试剂及药物  23-24
    2.5 主要试剂的配制  24
  3 实验方法及步骤  24-25
    3.1 制备藻酸钠/软骨细胞悬液  24
    3.2 制备圆柱形软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物  24-25
    3.3 筛选最佳超声参数改良软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物  25
  4 主要检测指标  25
    4.1 CCK-8检测软骨细胞数量  25
    4.2 免疫组化检测软骨细胞中Ⅱ型胶原的表达量  25
  5 统计学处理  25-26
  6 结果  26-28
    6.1 CCK-8检测不同组别凝胶内软骨细胞数量  26
    6.2 免疫组化检测不同组别凝胶中软骨细胞Ⅱ型胶原表达情况  26-28
  7 讨论  28-30
    7.1 三维培养的意义  28
    7.2 三维培养的支架材料  28
    7.3 构建组织工程化软骨的种子细胞浓度  28-29
    7.4 超声优化软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物的构建  29-30
  8 结论  30-31
  附图  31-33
第三部分经超声优化的软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物修复兔膝关节软骨缺损  33-46
  1 实验目的  33
  2 实验材料  33-34
    2.1 实验动物  33
    2.2 主要实验器械  33
    2.3 实验耗材与仪器  33
    2.4 主要试剂及药物  33-34
    2.5 主要试剂的配制  34
  3 实验方法及步骤  34-35
    3.1 软骨细胞/藻酸钙凝胶复合物的制备及超声干预  34
    3.2 制造兔膝关节软骨缺损模型  34-35
    3.3 实验分组  35
  4 主要观察指标  35-37
    4.1 一般情况观察  35
    4.2 修复组织的大体观察  35
    4.3 修复组织的组织学观察  35-36
      4.3.1 标本的HE染色  35
      4.3.2 番红O染色  35-36
      4.3.3 Ⅱ型胶原免疫组织化学  36
    4.4 组织学评分  36-37
  5 统计学处理  37
  6 结果  37-39
    6.1 一般情况观察  37
    6.2 修复组织大体观察  37-38
    6.3 修复组织的组织学观察  38
    6.4 组织学评分  38-39
  7 讨论  39-41
    7.1 实验动物麻醉剂的选择及模型的制备  39-40
    7.2 软骨损伤的中医药治疗  40
    7.3 LIPUS的类生长因子作用  40-41
  8 结论  41-42
  附图  42-46
参考文献  46-50
第四部分结论与展望  50-51
  1 结论  50
  2 展望  50-51
综述  51-57
  参考文献  54-57
攻读硕士期间获得的研究成果  57-58
致谢  58

低强度脉冲超声优化组织工程化软骨的构建及其修复关节软骨缺损的实验研究

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