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雌激素调控大鼠心肌细胞L型钙通道表达的作用及其机制

作　者: 毛晓芳
导　师: 金肆
学　校: 华中科技大学
专　业: 药理学
关键词: 雌激素 雌激素受体 L型钙通道 圈套寡核苷酸 CREB
分类号: R965
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


目的L型钙通道（L-type calcium channel，Ca-L），广泛存在于各种可兴奋细胞的细胞膜上，如心肌细胞、骨骼肌细胞、心血管平滑肌细胞、内分泌细胞、神经元细胞等。它在动作电位平台期的形成和维持以及启动心肌细胞兴奋-收缩耦联中发挥了极其重要的作用。已知Ca-L的功能改变是影响早后除极（earlyafterdepolarization， EAD）及尖端扭转性室性心动过速（torsade de pointes，TdP）发生的重要因素。已有的研究显示，雌激素是影响TdP易感性的重要因素，可以通过影响基因表达的机制上调家兔心肌细胞Ca-L主要功能亚单位Cav1.21C表达及L型钙电流(L-type calcium current，ICa-L。)。本研究旨在进一步探究雌激素调控Ca-L作用的信号转导机制。方法（1）用雌激素等不同药物孵育原代大鼠心肌细胞或大鼠心肌细胞株H9C2后，采用Western blot方法检测蛋白提取物中Cav1.21C表达的变化。（2）用雌激素等不同药物孵育大鼠心肌细胞系H9C2后，采用ELISA或Western blot方法检测蛋白提取物中核转录因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）及磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（phosphated cAMP response element bindingprotein，p-CREB）活性水平的变化。（3）设计合成CREB圈套核苷酸。利用oligofectamine转染试剂将CREB圈套核苷酸转染入H9C2细胞内，用雌激素刺激后，采用Western blot观察Cav1.21C蛋白水平的变化。（4）利用主动脉逆流灌注及2型胶原酶消化的方法，得到单个的原代家兔心室肌细胞。根据实验设计，给予原代家兔心室肌细胞或大鼠心肌细胞株H9C2雌激素等不同药物刺激。在电压钳模式下利用全细胞膜片钳技术记录ICa-L。结果（1）与对照组相比，雌激素（1100nM）孵育24h后可剂量依赖性的显著增加H9C2细胞的ICa-L。的电流密度（p <0.05）和Cav1.21C的蛋白表达量（p <0.05）；同样的，雌激素（100nM）孵育24h后也可显著增加原代大鼠心肌细胞的Cav1.21C的蛋白表达量（p <0.05），在采用雌激素受体抑制剂ICI182,780共同孵育后，雌激素上调Cav1.21C蛋白表达的作用被阻断。（2）与对照组相比，雌激素孵育30min内可显著增加p-CREB的表达（p <0.05），但随着时间的延长，p-CREB的活性表达有所下降。此外，与对照组相比，雌激素孵育后，可显著抑制转录因子NF-κB的活性（p <0.05）。（3）与雌激素处理组相比，磷脂酰肌醇3激酶（Phosphatidyl Inositol3-kinase，PI3K）抑制剂LY294002与雌激素同时孵育H9C2细胞后，Cav1.21C的蛋白表达量较雌激素单独处理组显著降低（p <0.05）；而丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）抑制剂U0126及蛋白激酶A（proteinkinase A，PKA）抑制剂KT5720分别与雌激素同时处理后，H9C2细胞Cav1.21C的蛋白表达量无明显变化。在家兔心肌细胞中的研究显示，与雌激素处理组相比，LY294002和KT5720均可显著抑制雌激素上调ICa-L。电流密度的作用（p <0.05），而U0126对雌激素上调ICa-L。的作用无明显影响。（4）PI3K抑制剂LY294002与雌激素共同孵育可显著抑制雌激素引起的p-CREB表达升高（p <0.05）。（5）在转染对照圈套寡核苷酸后，雌激素孵育后，H9C2细胞Cav1.21C的蛋白表达量明显增加（p <0.01）；与对照圈套寡核苷酸转染组相比，CREB圈套寡核苷酸显著降低雌激素引起的Cav1.21C的蛋白表达增加（p <0.01）。结论雌激素呈浓度依赖性的上调大鼠心肌细胞L型钙通道蛋白的表达和ICa-L。的电流密度，这一作用依赖于雌激素受体。雌激素可显著增加转录因子CREB的活性，同时也可显著抑制转录因子NF-κB的活性。PI3K抑制剂可显著抑制雌激素对H9C2细胞Cav1.21C蛋白表达增加的作用，而MAPK及PKA抑制剂则没有这种作用。但家兔心肌细胞中的结果表明，PI3K抑制剂和PKA抑制剂均可显著抑制雌激素上调ICa-L。的作用，而MAPK抑制剂不能抑制雌激素上调ICa-L。的作用。在H9C2细胞中，PI3K抑制剂可显著抑制雌激素引起的CREB活性增加，CREB圈套寡核苷酸可显著抑制雌激素上调Cav1.21C表达的作用。综合上述实验结果，雌激素可通过雌激素受体/PI3K/CREB通路上调H9C2细胞中Cav1.21C的蛋白表达。

全文目录


主要缩略词表（Abbreviation）  5-6
中文摘要  6-9
ABSTRACT  9-12
前言  12-15
材料和方法  15-30
实验结果  30-42
讨论  42-44
全文总结  44
参考文献  44-49
综述  49-70
  参考文献  59-70
工作小结  70-71
致谢  71-72

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学 > 实验药理学
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