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Tca4和Zorro2的转座激活与白念珠菌适应性形成的相关性研究

作　者: 苗琦
导　师: 姜远英
学　校: 第二军医大学
专　业: 药理学
关键词: 白念珠菌 反转录转座子 Tca4 Zorro2 耐药性
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


本课题研究发现，反转录转座子Tca4和Zorro2的转座激活与白念珠菌适应性形成之间存在紧密的联系。本研究成功的采用不同温度培养诱导白念珠菌，筛选出了高温（37℃）时对药物敏感性有所改变的子代。用实时定量RT-PCR方法检测白念珠菌敏感株ATCC10231及其温度长期诱导后对氟康唑更加敏感的菌株AT-37-44中反转录转座子Tca4中两个开放阅读框Orf19.2668和Orf19.2669的表达水平时，发现高温长期诱导菌株AT-37-44中的反转录转座子Tca4中的两个具有编码蛋白功能的开放阅读框的mRNA表达水平相对于ATCC10231有明显的升高。我们进一步采用Spotassay和生长曲线实验考查菌株对药物刺激的适应性，发现高温诱导菌株的适应性减弱。这些结果提示我们，白念珠菌在高温刺激的条件下可能通过激活反转录转座子来调控自身的适应性。本课题组成员前期用咪康唑长期诱导白念珠菌SC5314，获得菌株SC-m1、Sc-m2以及SC-m3，，我们在前期研究结果的基础上进一步探讨咪康唑诱导白念珠菌Zorro2的转座激活与适应性的相关性。采用实时定量RT-PCR方法检测白念珠菌敏感株SC5314及其咪康唑长期诱导形成耐药的菌株SC-m1、SC-m2、SC-m3中反转录转座子Zorro2及其两个编码蛋白的开放阅读框Orf19.7274和Orf19.7275的表达水平，发现咪康唑长期诱导菌株SC-m1、SC-m2、SC-m3中的反转录转座子Zorro2及其两个具有编码蛋白功能的开放阅读框的mRNA表达水平相对于SC5314有明显的升高。我们利用Southernblotting杂交实验检测咪康唑刺激白念珠菌Zorro2转座激活并引起耐药菌株与其亲本野生菌的基因组差异，发现转座子的条带增多，转座子的条带位置也有所改变，证明Zorro2确实发生了转座。第三部分是在第二部分的基础上研究Zorro2的转座激活对菌株适应性的影响。通过微量液基稀释法、菌斑分析法（Spotassay实验）、生长曲线实验、小鼠体内动物实验等方法，考察咪康唑长期刺激致Zorro2转座激活的白念珠菌与亲本菌相比，在对不同药物的耐药性，以及对动物的致病力等方面的差异。研究结果表明，咪康唑诱导转座激活的菌与亲本菌相比，对唑类药物、氧化应激、蛋白抑制剂等敏感性较弱，我们还通过小鼠体内动物实验考察了不同菌株对白念珠菌小鼠的感染情况，观察小鼠存活时间。结果显示：尾静脉注射感染咪康唑诱导菌株SC-m1、SC-m2和SC-m3组的存活时间比亲本菌组显著延长。可见，在本实验中菌株的耐药性增强反而使其毒力减弱。最后一部分是对白念珠菌适应性形成及Zorro2转座激活的机制探讨。为了考察咪康唑诱导菌株对药物的外转运能力我们用罗丹明6G外排实验考察了不同菌株对罗丹明6G的外排能力，发现咪康唑诱导菌株对罗丹明6G的外排能力明显增强。但是可促进罗丹明6G外排的耐药相关基因CDR1、MDR1，及其常见耐药相关基因的表达普遍下调。为了探讨SC-m1、SC-m2和SC-m3耐药性增强，而毒力减弱的可能机制，我们还观察了与耐药及毒力相关的菌丝的形成能力。发现耐药菌的菌丝形成能力与亲本菌相比明显降低，大部分是以酵母态形式存在的。磷脂酶是与毒力相关的一种酶，通过磷脂酶活性实验发现，耐药性强的菌株比亲本菌的磷脂酶活性显著降低（p<0.05），表明咪康唑诱导菌株的磷脂酶活性降低。为了验证菌株敏感性与Zorro2表达水平的相关性，我们分别检测了从51株临床分离白念珠菌对氟康唑的敏感性，并分别提取其总mRNA，利用实时定量RT-PCR技术检测其Zorro2RNA的含量，比较菌株敏感性与Zorro2表达RNA表达水平的相关性，更加证实了实验菌株产生耐药现象与Zorro2中的开放阅读框Orf19.7274的RNA高表达密切相关，与Orf19.7275的高表达也有一定关系，虽然Zorro2的RNA表达量在耐药菌中和敏感菌中没有显著性差异，但在耐药菌中的表达还是明显也是高于敏感菌，高表达发生率为48.14%，而敏感菌中仅为32%。因为临床上白念珠菌耐药现象的产生可能是多种作用机理共同作用导致的，其作用机制包括菌丝形成或产生生物被膜、外排泵蛋白的高表达、麦角甾醇生物合成通路改变、药物作用靶酶ERG11的变异或高表达等，反转录转座子的转座激活可能是白念珠菌耐药机制的又一调控途径。本课题的研究为进一步研究反转录转座子对白念珠菌耐药性形成的调控机制提供了理论基础。

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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