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ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶影响及分子机制的研究

作　者: 罗余萍
导　师: 熊玉卿
学　校:
专　业: 药理学
关键词: 载脂蛋白E 基因多态性 LDL受体氟伐他汀 HMG-CoA还原酶
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

背景：ApoE是血浆脂蛋白的重要成分，通过与LDL受体结合调节着体内的血脂水平。临床研究报道，ApoE的基因多态性对他汀类药物调节血脂的疗效有明显影响；而另有研究结果则提示阿托伐他汀调脂效应的差异似与ApoE基因多态性无关，孰是孰非尚需更多的研究证据予以评判。值得重视的是，ApoE与LDL受体结合参与体内脂质代谢，而他汀类药物抑制胆固醇合成的限速酶--HMG-CoA还原酶调节血脂，两条完全不同的作用途径如何产生影响和关联更加令人关注。因此，我们试图以ApoE基因多态性为切入点，运用细胞学和分子生物学的研究方式，探究ApoE的基因多态性对他汀类药物调脂效应的确切影响及其分子机制，为他汀类药物调血脂作用的研究拓展新思路。目的:本课题通过比较不同基因亚型ApoE与LDL竞争性结合的差异，分析ApoE调脂效应的作用位点；采用RT-PCR检测HMG-CoA还原酶mRNA表达，比较不同基因亚型ApoE对氟伐他汀、丹参素及两者联合应用抑制HMG-CoA还原酶的影响；探讨ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶的确切影响位点及分子机制。方法：1. ApoE竞争性结合实验：建立HSF细胞模型，系统摸索LDL与LDL受体结合时间、LDL浓度等最佳实验条件；制备不同基因亚型的ApoE-DMPC复合体；建立ELISA检测方法，用来检测不同基因亚型ApoE-DMPC复合体与LDL竞争性结合而置换的LDL量。2. HMG-CoA还原酶mRNA表达实验：建立L-02细胞模型，系统摸索细胞培养血清、药物作用时间和ApoE浓度等最佳实验条件；采用RT-PCR检测L-02细胞中HMG-CoA还原酶mRNA表达量，表达量以灰度值比表示。3.通过ApoE竞争性受体结合实验，观察ApoE2（Arg112→Cys）(突变型E2)、ApoE3(野生型E3)、ApoE4（Cys158→Arg）(突变型E4)三种基因亚型ApoE-DMPC复合体与LDL竞争性结合活性的差异。4.通过RT-PCR检测HMG-CoA还原酶mRNA表达量，考察野生型E3、突变型E2、突变型E4三种基因亚型分别对氟伐他汀、丹参素、氟伐他汀与丹参素联合应用抑制HMG-CoA还原酶表达的影响；综合分析ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶影响的位点及分子机制。5.数据处理与统计分析。通过双倒数作图法计算IC50；抑制率=（空白组灰度值比－实验组灰度值比）/空白组灰度值比×100%；所有数据均以平均数±标准差（mean±SD）表示，统计分析采用SPSS软件进行数据处理，多样本组间差异采用方差齐性检验，两两比较采用独立样本t检验。统计结果以P>0.05表示差异无统计学意义，P<0.05表示有显著性差异，P<0.01表示有极显著性差异。结果：1.本研究建立的ELISA检测LDL方法灵敏度高，精密度、准确度均符合实验要求。线性范围为0.2-12.8μg/ml。竞争性受体结合实验的最佳结合时间为120min、LDL与受体的结合量为1.59±0.07μg/mg protein。LDL在浓度范围为2-50μg/ml时与受体的结合量呈线性增加。2.血清培养的L-02细胞中，RT-PCR检测HMG-CoA还原酶mRNA表达灰度值比为0.38±0.02，无血清诱导24h后的灰度值比上升到0.86±0.01。而氟伐他汀作用L-02细胞24h时，HMG-CoA还原酶mRNA灰度值比0.49±0.01。最适实验条件为血清培养24h。野生型E3、突变型E2、突变型E4的实验浓度分别为0.36、0.50、0.63μg/ml。3.野生型E3、突变型E2、突变型E4三种基因亚型与LDL竞争性结合的LDL最大置换量分别为6.84±0.23，3.92±0.40，6.30±0.32μg/mg protein；IC50分别为0.05±0.01，0.35±0.02，0.24±0.01μg/ml，方差齐性检验显示三组间有显著性差异（P<0.05），突变型E2、E4与野生型E3两两比较，差别有统计学差异（P<0.01，P<0.01），两种突变型E2、E4受体结合活性低于野生型E3，且突变型E2受体结合活性低于突变型E4（P<0.01）。4.系列浓度的氟伐他汀、丹参素对HMG-CoA还原酶mRNA表达抑制的IC50分别为1.62±0.11、3.00±0.14；IC50对应的HMG-CoA还原酶表达的抑制率分别为24.13±0.20%、15.11±0.31%；最大抑制率分别为48.26±0.40%、30.21±0.62%，可见氟伐他汀、丹参素均能显著抑制HMG-CoA还原酶，且氟伐他汀抑制作用更强，差异有统计学意义（P<0.01）。合用1.62μg/ml氟伐他汀与3.00μg/ml丹参素时，看到其对HMG-CoA还原酶mRNA表达的抑制率为34.61±0.45%，比单用氟伐他汀（24.13±0.20%）、单用丹参素（15.11±0.31%）的酶抑制率明显增大，t检验显示差异显著（P<0.01）；明确的显示了抑制HMG-CoA还原酶活性的协同效应。5.当加入野生型E3、突变型E2和E4时，氟伐他汀（IC50浓度1.62μg/ml）对HMG-CoA还原酶的抑制率分别为18.59±1.09%、23.49±0.37%、12.13±0.91%，均小于未加入ApoE组。将野生型E3组与未加ApoE相比，其HMG-CoA还原酶抑制率有统计学差异（P<0.01）；而突变型E2组和突变型E4组的差异则不相同（P>0.05，P<0.01）；突变型E4组与野生型E3组二者比较显示氟伐他汀对HMG-CoA还原酶抑制率差异具有统计学意义（P<0.01）；由此可见，ApoE2112位Arg突变为Cys似与氟伐他汀对HMG-CoA还原酶抑制率的变化无关。当加入野生型E3、突变型E2和E4时，丹参素（IC50,3.00μg/ml）对HMG-CoA还原酶mRNA表达的抑制率分别为9.94±1.05%、6.54±0.47%、22.46±1.21%。野生型E3组和突变型E2组HMG-CoA还原酶抑制率小于未加ApoE组，差异均有显著统计学意义（P<0.01）；而突变型E4组的结果则相反：HMG-CoA还原酶明显增大，与野生型E3组比较具有显著统计学意义（P<0.01，P<0.01）；由此可见，ApoE4158位Cys突变似可增强丹参素对HMG-CoA还原酶的抑制效应。6.当加入野生型E3、突变型E2和E4时，联合作用1.62μg/ml氟伐他汀与3.00μg/ml丹参素对HMG-CoA还原酶mRNA表达的抑制率分别为24.68±2.63%、11.08±1.38%、33.69±1.65%。野生型E3组和突变型E2组HMG-CoA还原酶抑制率小于未加ApoE组；差异均有显著统计学意义（P<0.01）；而突变型E4组的比较结果差异无统计学意义（P>0.05），这可能与ApoE4158位Cys突变增强丹参素抑酶效应有关。结论：系统从细胞和分子位点水平研究ApoE基因多态性对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶的影响机制，成为了本文的创新之处。1.结果表明，ApoE2112位Arg（精氨酸）突变为Cys（半胱氨酸）及ApoE4158位Cys突变为Arg均会导致受体结合活性比野生型E3更低，但突变型ApoE2与野生型E3之间的差异比突变型E4与野生型E3之间的差异更大，突变型E2与突变型E4之间差异有统计学差异。提示112位为ApoE的主要突变位点。2.结果表明，氟伐他汀与丹参素均有抑制HMG-CoA还原酶表达的作用，且氟伐他汀比丹参素抑制作用更强；氟伐他汀与丹参素联合应用时抑制HMG-CoA还原酶具有协同效应。3.结果提示，氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达作用与ApoE2112位Arg突变为Cys无关，丹参素抑制HMG-CoA还原酶mRNA表达作用与ApoE4158位Cys突变为Arg有关联；与无ApoE相比，突变型E2、突变型E4存在时，氟伐他汀与丹参素抑制酶表达作用大部分表现为减小。由此可以推论，ApoE112和158位点的突变而导致的LDL置换量的降低会减小氟伐他汀及丹参素对HMG-CoA还原酶表达的抑制作用。但令人费解的是，突变型E2对氟伐他汀抑制HMG-CoA还原酶的作用几乎没有影响，而突变型E4存在时，丹参素的抑制作用却比无ApoE时显著增强，原因可能是突变型E2与氟伐他汀、突变型E4与丹参素形成了某种复合物而影响了整个过程，但它们之间的确切关系，需要更进一步深入研究。4.实验结果进一步说明，氟伐他汀与丹参素联合应用时，野生型E3组和突变型E2组HMG-CoA还原酶抑制率小于未加ApoE组；而突变型E4组与无ApoE时差异无统计学意义。这可能与ApoE4158位Cys突变增强丹参素抑酶效应有关。5.ApoE112位和158位基因突变时，均会导致氟伐他汀与丹参素抑制HMG-CoA还原酶的作用发生变化。故氟伐他汀与丹参素在临床用药时应密切关注患者ApoE不同位点的突变情况。

全文目录

摘要  3-7
ABSTRACT  7-16
中英文缩略词表  16-17
第1章引言  17-20
第2章 ApoE 不同基因亚型与 LDL 竞争性结合 LDL-r 实验  20-33
  2.1 材料  20-21
    2.1.1 人皮肤成纤维细胞（HSF）株  20
    2.1.2 主要试剂  20
    2.1.3 主要仪器  20-21
  2.2 方法  21-24
    2.2.1 ApoE-DMPC 复合物制备  21
    2.2.2 HSF 细胞培养  21-22
    2.2.3 ApoE 与 LDL 竞争性结合 HSF 细胞 LDL-r 试验  22-24
    2.2.4 统计分析  24
  2.3 结果  24-30
    2.3.1 HSF 培养  24-25
    2.3.2 ApoE 与 LDL 竞争性结合 HSF 细胞 LDL 受体试验结果  25-30
  2.4 讨论  30-33
第3章 ApoE 基因多态性对氟伐他汀抑制 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达的影响  33-53
  3.1 材料  33-34
    3.1.1 人胚肝细胞 L-02 细胞株  33
    3.1.2 主要试剂  33
    3.1.3 主要仪器  33-34
  3.2 方法  34-39
    3.2.1 溶液配制  34
    3.2.2 L-02 细胞的培养  34-35
    3.2.3 L-02 细胞生长曲线绘制  35
    3.2.4 MTT 法检测药物对 L-02 细胞的增殖抑制作用  35
    3.2.5 RT-PCR  35-37
    3.2.6 血清对 L-02 细胞 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达的影响  37
    3.2.7 药物作用时间对 L-02 细胞 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达抑制的影响  37
    3.2.8 ApoE 浓度对 L-02 细胞中 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达抑制的影响  37-38
    3.2.9 氟伐他汀浓度对 L-02 细胞中 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达抑制的影响  38
    3.2.10 ApoE 不同基因亚型对氟伐他汀抑制 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达的影响  38
    3.2.11 ApoE 不同基因亚型对氟伐他汀与丹参素联合抑制 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达的影响  38
    3.2.12 统计分析  38-39
  3.3 结果  39-50
    3.3.1 L-02 细胞培养  39-40
    3.3.2 L-02 细胞生长曲线  40
    3.3.3 MTT 法检测药物对 L-02 细胞的增殖抑制作用  40
    3.3.4 RNA 纯度及完整性鉴定  40-41
    3.3.5 血清对 L-02 细胞 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达的影响  41-42
    3.3.6 药物作用时间对 L-02 细胞中 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达抑制的影响  42
    3.3.7 ApoE 浓度对 L-02 细胞中 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达抑制的影响  42-44
    3.3.8 氟伐他汀浓度对 L-02 细胞中 HMG-CoA 还原酶 mRNA 表达抑制的影响  44-46
    3.3.9 ApoE 不同基因亚型对氟伐他汀抑制 HMG-CoA 还原酶表达的影响  46-48
    3.3.10 ApoE 不同基因亚型对氟伐他汀与丹参素联合抑制 HMG-CoA 还原酶表达的影响  48-49
    3.3.11 氟伐他汀丹参素联合应用与单独作用对 HMG-CoA 还原酶 mRNA表达抑制作用统计分析  49-50
  3.4 讨论  50-53
第4章结论与展望  53-56
  4.1 结论  53-54
  4.2 展望  54-56
致谢  56-57
参考文献  57-62
攻读学位期间的研究成果  62-63
综述  63-74
  参考文献  70-74

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