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研究背景：视网膜母细胞瘤(retinoblastoma, Rb)是婴幼儿最常见的一种原发性眼内恶性肿瘤,严重危害患儿生命及视功能。随着临床治疗水平的不断提高,治疗的目标也从单纯局限于保护患儿生命转向立足于提高患儿的生存质量,即保留眼球和有用视功能的方向发展,而实现这一目标的最关键问题在于患儿的早期发现和诊断。由于Rb患儿的年龄一般都在3岁以下,肿瘤的早期发现相当困难,这不仅是由于儿童眼底检查配合不佳,更是缺乏清晰、直观的检查成像手段所造成的。广域数字化小儿视网膜图像系统(wide-field digital pediatric retinal imaging system, RetCam Ⅱ)作为目前最先进的儿童眼底成像技术为Rb的防治及持续随访提供了极大地便利。但长期以来仍缺乏对于Rb临床信息的完整收集及整理分析系统,只能采取简单的文字描述或绘图进行记录,不利于患儿临床长期随访观察和持续的综合治疗疗效评估。有鉴于此,我们希望利用计算机技术建立一套收集Rb图像和文字信息的图文一体化系统,为Rb的防治研究提供信息支持。通过吸入麻醉下的眼底成像技术与信息采集系统相结合的Rb图文系统,可以使眼科医师获得全面完整、准确直观的患儿信息资料,促进了Rb的临床诊断、治疗和随访等各个方面的发展,更好的把握Rb的眼底表现特征和病变进展情况,有效的帮助临床医师采取合理干预措施,对于提高患儿的生存质量也具有重要的价值。本研究创建的一整套的检查方式和图文输出,在临床教学和科研中也具有良好的应用前景。目前,随着化疗为主的综合治疗的兴起,Rb患儿的诊疗模式也发生了巨大的变化,常规外放射治疗渐渐淡出主流治疗范围,原有的Reese-Ellsworth5级分期体系已不再能够适应新的要求,本世纪初产生了新的视网膜母细胞瘤国际分期(International Intraocular Retinoblastoma Classification, IIRC),2005年全球共有27个中心参与,包括我国的同仁眼科中心,证明了IIRC对于Rb化疗的指导作用。但我国Rb患儿就诊时多为晚期,保守治疗效果相对较差。因此,临床治疗仍是目前面临的最主要最现实的问题,我院自2008年开始组建了Rb专业治疗组,开展现代Rb的综合治疗,取得了不错的效果,同时收集了丰富的临床资料。本课题由此点出发,通过对近5年来的Rb综合治疗以及23G微创玻璃体手术联合球内注药化疗的新型治疗方式做一全面的评估与分析,以达到提高Rb治疗水平、探索符合我国国情的个体化治疗手段的目的。长期以来,防止Rb的复发和转移是其治疗中最为棘手的难点。40年前,Folkman首次提出肿瘤的生长和转移是有血管依赖性的,因此阻断肿瘤的血管化可以作为肿瘤治疗的有效策略。VEGF及其相关的因子作为刺激血管生成的最强大的细胞因子群在肿瘤新生血管化的过程中占据中心地位,是介导新生血管生成的关键因素。有鉴于此,结合以上思路,我们选取综合治疗成功和失败的部分Rb患儿,抽取其血清,运用RayBiotech人血管生成相关细胞因子芯片检测治疗后Rb患儿血清中43种VEGF及其相关细胞因子的表达情况,整体的、动态的评估蛋白质分子水平的变化情况,从VEGF及其相关因子群为核心的肿瘤新生血管化的角度探讨Rb的临床治疗预后和侵袭转移机制。机体生理机能的真正执行者是蛋白质,因此从蛋白质水平对疾病进行研究显得特别重要。抗体芯片技术作为一种高通量的分子蛋白检测技术,继承了免疫荧光、化学发光和微列阵技术的诸多特点,逐渐发展成为从整体角度定性和定量检测蛋白质分子的研究平台,在各种疾病的相关分子发现、分子诊断和疗效评价方面发挥重要作用,具有良好的应用前景。本研究希望利用这一技术从整体的宏观角度了解肿瘤血管新生化的微环境中复杂的细胞因子网络调控机制,从而探索未来潜在的Rb治疗新的介入手段和干预策略。研究目的：1.建立视网膜母细胞瘤临床图文信息采集系统,收集管理Rb患儿所有的临床信息及眼底图片资料,为掌握Rb发病的机制和规律,总结和探索Rb治疗特点奠定基础。2.探讨视网膜母细胞瘤临床诊治与IIRC分期特点3.研究视网膜母细胞瘤综合治疗的特点并探讨其相关临床因素,探索适合国情的个体化综合治疗方式；初步总结23G微创玻璃体手术联合球内注药化疗治疗Rb的临床经验和预后效果,摸索晚期Rb治疗的新方法；同时研究眼摘前的化疗与晚期Rb患儿肿瘤转移及死亡率的相关性。4.利用细胞因子抗体芯片检测技术检测综合治疗保眼成功和失败的相同分期患儿治疗后血清中43种血管生成相关细胞因子的表达变化,从肿瘤新生血管化的角度探讨Rb的临床治疗和侵袭转移机制。研究方法：1.使用AVA软件语言,建立视网膜母细胞瘤临床信息采集系统,收集整理近十年的Rb临床资料,为分析Rb的诊疗特点及规律提供信息支持。2.回顾性分析我院2003年至2012年十年间116例Rb患儿的临床资料。3.分析我院从2009年至2012年间进行综合治疗的75例Rb患儿的临床资料,综合治疗的方法包括：化疗、局部治疗(激光或冷冻)、眼球摘除、玻璃体手术联合球内注药。其中采取以化疗为主联合局部治疗+眼摘治疗的患儿65例,其余10例为23G微创玻璃体手术联合球内注药化疗的手术干预治疗。4.利用pTNM分级和特定疾病生存率(Disease-specific survival, DSS)的方法研究眼摘前的化疗与晚期Rb患儿肿瘤转移及死亡率之间的相关性。5. RayBiotech人血管生成相关细胞因子芯片检测治疗后不同预后的Rb患儿血清中43种细胞因子的表达情况。6.数据分析采用版本2.15.1的R统计软件中的卡方检验,T检验,Fisher’s精确检验,Wilcoxon等级总和检验和生存率分析。P≤0.05认为有显著性差异。结果：1.建立了视网膜母细胞瘤临床信息的采集系统,主要有三个模块组成：文字报告模块、影像图片模块及病例查询模块,系统可以生成完整的Rb患儿图文报告资料。2.分析116例Rb患儿临床资料的IIRC特点,其中单眼患儿为79例(68.1%),双眼患儿为37例(31.9%)；有遗传性家族史的单眼患儿为1例(1.27%),双眼患儿为5例(13.51%),两者经统计分析有显著性差异,P<0.05；在Rb患儿中最常见的初诊症状为白瞳症,比例为78.4%；性别方面男性74例(63.79%),女性42例(36.21%)；患儿总体的初诊时间、诊断滞后时间及随诊时间分别为21.49个月、5.14周及30.72个月,单眼患儿的初诊时间为24.27个月,双眼患儿为15.1个月,单双眼患儿的初诊时间经统计分析有显著性差异,P≤0.05；所有患儿中肿瘤为单个瘤体的占75%,多个瘤体的占25%；Rb患儿的IIRC国际分期方面,所有153只患眼中A期占5只(3.27%),B期占7只(4.58%),C期占11只(7.19%),D期占56只(36.60%),E期占69只(45.10%),自发退变的占4只(2.61%),另有1只眼由于在外院摘除而分期不明；所有患眼中眼球摘除的有97眼,占63.4%,总体保眼率为36.6%；从各分期的保眼率来看A期为5眼(100%),B期为7眼(100%),C期为9眼(81.82%),D期为24眼(42.86%),E期为10眼(14.49%),其余自发退变的4眼中有3眼由于萎缩而摘除。经统计学分析A、B、C期之间无显著性差异,P>0.05；A、B、C期与D、E期之间均有显著性差异,P≤0.05。3.化疗为主联合局部治疗+眼摘治疗的所有65例92眼(双眼27例,单眼38例)Rb患儿四年的总生存率为92.3%,A期至E期的生存率分别为100%、100%、100%、95%和90.00%,经统计学分析显示各期存活率差异无统计学意义,P>0.05；所有患儿总的保眼率为51%,A期至E期的保眼率分别为100%、100%、85.70%、77.10%和10%,各组间采用两独立样本卡方检验,A、B、C、D各期之间保眼率无显著性差异,P>0.05；但E期和其他各期之间保眼率均有显著性差异,P<0.05；中低风险Rb患儿综合治疗结果：A,B,C期共15只眼,治疗成功14只眼,失败1只眼,治疗成功率为93.3%；高风险Rb患儿综合治疗结果：D、E期Rb患儿共60例,采用化疗联合局部治疗保眼的共42例,分别为D期18例和E期24例,D期的保眼治疗成功率为61.1%(11/18),E期的保眼治疗成功率为16.7%(4/24),其余18例均为单纯眼摘或眼摘后化疗的患儿。进一步分析42例D期和E期的保守治疗与临床因素相关性,治疗成功与失败患儿的初诊时间分别为12和16.1个月,随访时间分别为22.47和28个月,经统计学分析均无显著性差异,P>0.05；与肿瘤位置相关性分析,将42例患儿眼内肿瘤的位置分为3组即：后极部、周边部(包括中周部)和后极部+周边部,三组治疗成功的例数分别为4例,6例,5例；成功率分别为23.50%,85.70%,27.80%,经卡方分析后极部与周边部、周边部与后极部+周边部有显著性差异,P≤0.05；42例患儿中有4例死亡,全部为肿瘤位置处于后极部的患儿,其他两组位置的患儿均无死亡,经统计学分析,后极部与后极部+周边部两组之间有显著性差异,P≤0.05；另外各组间均无显著性差异,P>0.05。4.23G微创玻璃体手术联合球内注药化疗治疗的Rb患儿10例,平均术后随访时间6.4个月,术中硅油填充的患儿有4例,其中2例已经取出硅油,有7例患儿术后视力有提高,1例同术前,2例下降,所有患儿眼球保存,保眼率为100%,未发现眼外转移,肿瘤灶基本钙化萎缩,1例患儿术后发生玻璃体少量出血,2例术后发生轻度脉络膜脱离,1例发生持续球结膜水肿,后经治疗好转,未发现其他严重并发症。5.用pTNM分级和特定疾病生存率(DSS)的分析方法对41例的Rb组织病理学报告(26男,15女,双眼16例,单眼25例,摘除的眼球13眼为D期,28眼为E期)进行研究。每位患者仅以一只眼分期纳入统计,双侧Rb患者按病情较重侧患眼的分期参与研究。眼球摘除术作为首选治疗方式的有16只眼,另外25只眼为眼摘前做了化疗治疗的。这两组在性别,单侧与双侧发病,患眼的国际分级或者诊断年龄方面经统计学分析无显著性差异,P>0.05。五名死亡的患儿均为眼摘前化疗组E期患儿,双眼两名,单眼3名。双眼患儿整体的平均诊断年龄为19.3个月,范围2-54个月,单眼患儿整体的平均诊断年龄为25.5个月,范围4-72个月；首选治疗是眼摘的生存患儿的随诊时间(平均31.1个月,范围11-52个月)长于眼摘前化疗的生存患儿随诊时间(平均26.4个月,范围10-50个月)。首选眼球摘除的患儿从诊断到眼球摘除的平均时间是0.9个月,而眼摘前化疗的患儿从诊断到眼球摘除的时间中位数是5.7个月,经统计学分析有显著性差异,P≤0.05。患儿特定疾病生存率分析：患儿的生存时间从诊断时开始计算,死亡患儿到死亡日期止。由于死亡患儿均为E期的患者,因此比较E期未行化疗直接眼摘患儿与眼摘前行化疗治疗患儿的DSS,经统计学分析两者接近有显著性差异,P=0.05。眼摘时间推迟3个月以上的患儿相对于3个月内眼摘的患儿DSS有显著性差异,P<0.05。分析41例眼球摘除的病理组织片的pTNM分级,总体来看,眼摘前化疗组患儿与未化疗组患儿pTNM的风险性相比,两者无显著性差异,P>0.05；但在高风险方面,眼摘前化疗组患儿的比例为12%,而眼摘前未化疗组患儿的比例为37.5%,前者的高风险比例明显要少；分期比较,在D期中两组具有显著性差异,P<0.05,即化疗组比未化疗组的风险低；但在E期的患儿中两组的风险性没有显著性差异,P>0.056.抽取综合治疗后保眼成功和失败的Rb患儿外周血,进行血清中43种血管生成相关细胞因子的抗体芯片检测,结果发现11种细胞因子的表达发生改变,有显著性差异。其中：发生表达上调的2种,为IFN-γ和Endostatin;发生表达下调的9种,为ENA-78、Angiopoietin-2、VEGF-R2、MCP-1、VEGF、 MMP-9、IL-1β、PIGF和Tie-2。结论：1.使用Java语言程序创建了Rb患儿临床信息的图文采集系统,可以完整的搜集、整理各种患儿信息资料,并可将资料数据以EXECL表的形式输出,同时可以形成包含患儿病情和诊疗情况的图文报告。2.白瞳症是Rb患儿中的初诊症状中比例最高的临床表现,超过患儿总数的3/4；与国外相比,我国患儿的初诊时间和病程普遍偏晚,且肿瘤以单发为主所占比重最大,比率达到75%；分期上也以D期和E期为主的晚期病患为主,超过了80%。治疗上,保眼率为36.6%,且眼摘率和分期密切相关。说明我国的Rb诊断和治疗水平还比较低,患者发现时多病情严重,预后不佳,需要加强对民众的Rb健康教育,提高Rb早期诊断的水平,探索出新的有效且经济的个体化治疗新方法。3.化疗为主联合局部治疗+眼摘治疗的综合治疗手段提高了Rb患儿的生存率,但患者的生存率和保眼率与其临床分期密切相关,晚期病例的治疗效果不佳,眼摘率较高；同时治疗预后与肿瘤所处的位置有高度相关性。肿瘤的位置对于临床治疗的选择性具有指导意义,也是影响临床Rb综合治疗疗效的重要因素。4.对于晚期的化疗失败或效果不佳的Rb患儿,玻璃体手术联合球内注药的治疗新方法短期内的观察效果良好,保眼率为100%,且术后未见严重的手术并发症,是一种安全有效的治疗手段,但还需要今后大样本长期的观察评估。5.如果从诊断到眼球摘除的时间超过3个月,对那些组织病理学上分期较差的严重E期Rb患儿进行眼摘前的化疗治疗,同时没有密切监控和适当的对高风险因素的处理,可能将导致因为转移或复发造成的死亡率升高。研究结果提示在晚期的Rb治疗中要适度掌握治疗的分寸,即如何避免保眼治疗后带来的可能肿瘤转移问题,在何种情况下要及时坚决的摘除眼球或采取保眼治疗,怎样把握两者之间的平衡关系是今后需要深入研究和总结的关键问题。6.使用细胞因子抗体芯片技术可以检测不同预后的Rb患儿血清中血管生成类细胞因子的表达变化情况,以VEGF/VEGF R2和Ang2/Tie2为核心的肿瘤血管化是Rb综合治疗预后效果的重要影响因素,肿瘤的预后转归是一个以血管生成化为核心的、复杂的涉及免疫、炎症、转移侵袭、凋亡的病理生理过程,VEGF/VEGF R2和Ang2/Tie2可以作为今后Rb治疗的新的靶点,具有巨大的潜在临床应用价值。创新点：1.构建了一套行之有效的视网膜母细胞瘤图文信息采集系统。2.提出了23G微创玻璃体手术联合球内注药化疗治疗晚期视网膜母细胞瘤的新思路,并进行了初步总结,为Rb综合治疗提供了新的手段。3.提出了过度化疗或保眼治疗可能引起晚期视网膜母细胞瘤患儿死亡率增加或转移风险升高。4.提出Rb治疗转归的核心为肿瘤血管化,VEGF/VEGF R2和Ang2/Tie2可以作为今后Rb治疗的新的靶点。
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