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片仔癀对人骨肉瘤阿霉素耐药细胞的作用及机制探讨

作　者: 张燕
导　师: 张俐
学　校: 福建中医药大学
专　业: 中医骨伤科学
关键词: 片仔癀 骨肉瘤细胞 耐药 阿霉素 移植瘤
分类号: R738.1
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的本实验以人骨肉瘤U20S细胞经ADM诱导建立的骨肉瘤ADM耐药细胞和相应的耐药细胞裸鼠移植瘤模型为研究对象,观察片仔癀对人骨肉瘤ADM耐药细胞的作用并探讨其可能的机制,为临床应用片仔癀逆转骨肉瘤耐药提供实验依据。方法1、人骨肉瘤U20S细胞ADM耐药细胞株的建立及其耐药机制采用大剂量间隙作用、浓度梯度递增间隙作用建立人骨肉瘤U20S细胞ADM耐药株分别命名为U2OS/ADM1、U2OS/ADM2,光镜及透射电镜下观察细胞形态变化；MTT法绘制生长曲线计算倍增时间,测定其耐药指数及药物敏感性；FCM检测细胞内Rh123蓄积情况；RT-PCR检测MDR1、MRP1及Survivin mRNA的表达；Western blot检测P-gp、MRP1及Survivin蛋白的表达。2、片仔癀对人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞的作用采用MTT法确定无细胞毒作用的片仔癀IC10浓度为联用浓度,MTT检测片仔癀、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞增殖的影响,利用金氏公式求Q值,进行合用效果判断；Hoechst33258染色、Annexin V-FITC/PI双染FCM检测片仔癀、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞凋亡的影响。3、片仔癀逆转人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞耐药的机制采用FCM检测片仔癀对U2OS/ADM2细胞内Rh123蓄积的影响、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞内ADM蓄积的影响；RT-PCR检测不同浓度片仔癀、无细胞毒作用浓度的片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞Bcl-2、Bax. Survivin、MDR1mRNA表达的影响；Western blot去检测Bcl-2-、Bax、Survivin、P-gp蛋白的表达。4、片仔癀对人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤的作用采用人骨肉瘤耐药株U2OS/ADM2细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,观察片仔癀、ADM、片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤体积、重量的影响,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤抑制率(IR),TUNEL法检测移植瘤细胞凋亡情况,RT-PCR检测Bcl-2、Bax、MDR1mRNA在移植瘤中的表达。结果1、成功建立了人骨肉瘤U20S细胞ADM耐药株U2OS/ADM1、U2OS/ADM2,镜下观察U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞较亲本细胞U2OS在形态上发生了显著变化,透射电镜观察发现耐药株细胞内空泡增多,核糖体增多,粗面内质网扩张；U2OS/ADM1与U2OS/ADM2细胞倍增时间延长,与U2OS细胞相比差异明显(PF)<0.01)；U2OS/ADMK、U2OS/ADM2细胞的耐药指数(RI)分别为79.63和91.06,同时对紫杉醇、顺铂交叉耐药；细胞内Rh123蓄积量明显低于U2OS细胞(P<0.01),而两种耐药株对Rh123的蓄积无明显差异(P>0.05)；U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞中MDR1/P-gp、MRP1及Survivin基因及蛋白的表达均明显高于U2OS细胞(P<0.05),且U2OS/ADM2细胞中MRP1的表达较U2OS/ADM1细胞明显上调(P<0.05)。2、片仔癀对U2OS/ADM2细胞增殖具有抑制作用,呈时间和剂量依赖性；片仔癀可促进U2OS/ADM2细胞凋亡,凋亡率随片仔癀浓度的增大而增加；U2OS细胞和U2OS/ADM2细胞对片仔癀的IC50无明显差异(P>0.05),U2OS/ADM2细胞对片仔癀无交叉耐药性。片仔癀对U2OS/ADM2细胞无毒性作用的药物浓度(IC10)为0.4mg/ml。 U2OS/ADM2细胞对ADM的IC50为(14.57±0.15)μg/ml,0.4mg/ml片仔癀与ADM联用后其对ADM的IC50为(6.75±0.29)μ g/ml,逆转指数为2.16；Q值为2.29;0.4mg/ml片仔癀与ADM联用后细胞凋亡率与单用ADM相比明显增加(P<0.05)。3、片仔癀可增加细胞内P-gp底物Rh123的蓄积,下调U2OS/ADM2细胞中Bcl-2、Survivin、MDR1/P-gp的表达,上调Bax表达,且呈剂量依赖性,与对照组相比有明显差异(P<0.05)；0.4mg/ml片仔癀与ADM联用后细胞内ADM荧光强度为对照组的1.27倍(P<0.05),与对照组、单用ADM组相比,联用组Bcl-2、Survivin、MDR1/P-gp的表达下调,而Bax的表达上调,差异具有统计学意义(P<0.05)。4、成功建立了U2OS/ADN2细胞裸鼠移植瘤模型,片仔癀与ADM联用组裸鼠移植瘤的体积、重量与片仔癀组、ADM组相比明显降低(P<0.05)。TUNEL检测显示联用组凋亡指数明显高于片仔癀组、ADM组,差异有统计学意义(P<0.01)。RT-PCR结果显示片仔癀与ADM联用可明显上调Bax mRNA的表达,降低Bcl-2、MDR1mRNA的表达,与单用片仔癀和单用ADM相比差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1、采用ADM大剂量间隙作用、浓度梯度递增间隙作用法均可建立人骨肉瘤ADM耐药细胞株,耐药机制与MDR1、MRP1、Survivin过表达有关；不同建立方式存在一定差异,浓度梯度递增间隙作用法建立的耐药细胞耐药性更明显。2、片仔癀能够有效抑制U2OS/ADM2细胞的增殖,促进其凋亡,呈时间和剂量依赖性；无细胞毒作用的片仔癀与ADM可产生协同作用,提高U2OS/ADM2细胞对ADM的敏感性,表明片仔癀具有逆转U2OS/ADM2细胞耐药的作用。其机制与抑制P-gp的表达,改变Bcl-2与Bax的比例,下调Survivin的表达有关。3、片仔癀与ADM联用可明显抑制U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤的生长,促进其凋亡,其机制与上调Bax表达,下调Bcl-2、MDR1的表达有关。

全文目录


目录  4-8
中文摘要  8-11
Abstract  11-14
中英文缩略词表  14-16
前言  16-18
第一章 骨肉瘤耐ADM细胞株的建立及其耐药机制  18-36
  1 研究目的  18
  2 实验材料  18-20
    2.1 细胞株  18
    2.2 主要试剂  18-19
    2.3 主要实验仪器  19
    2.4 主要试剂的配制  19-20
  3 实验方法  20-27
    3.1 细胞复苏  20
    3.2 细胞培养  20
    3.3 细胞传代  20
    3.4 细胞计数  20-21
    3.5 细胞冻存  21
    3.6 耐药株的建立  21
    3.7 药敏实验  21-22
    3.8 耐药株细胞耐药稳定性检测  22
    3.9 光镜及透射电镜观察细胞形态  22
    3.10 细胞生长曲线和细胞群体倍增时间的测定  22-23
    3.11 Rh123蓄积实验  23
    3.12 RT-PCR检测MDR1、MRP1、Survivin mRNA表达  23-25
    3.13 Western blot检测P-gp、MRP1、Survivin蛋白表达  25-27
    3.14 统计学处理  27
  4 结果  27-32
    4.1 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2耐药细胞的建立及耐药稳定性  27-28
    4.2 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞的多药耐药性  28-29
    4.3 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞形态学观察  29
    4.4 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞生长情况  29-30
    4.5 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞Rh123蓄积实验  30-31
    4.6 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞MDR1、MRP1、Survivin mRNA的表达  31
    4.7 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2细胞P-gp、MRP1、Survivin蛋白的表达  31-32
  5 讨论  32-35
    5.1 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2耐药株的建立  32-33
    5.2 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2耐药株生物学特性  33
    5.3 U2OS/ADM1、U2OS/ADM2的耐药机制  33-35
  6 小结  35-36
第二章 片仔癀对人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞的作用  36-48
  1 研究目的  36
  2 实验材料  36
    2.1 细胞及细胞培养  36
    2.2 主要试剂  36
    2.3 主要实验仪器  36
  3 实验方法  36-38
    3.1 药物配制  36
    3.2 MTT法检测片仔癀对U2OS/ADM2增殖的影响  36-37
    3.3 MTT法确定片仔癀联用浓度的确定  37
    3.4 MTT法检测片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞增殖的影响  37-38
    3.5 Hoechst 33258染色法观察细胞凋亡形态  38
    3.6 AnnexinV-FITC/PI双染FCM检测细胞凋亡  38
    3.7 统计学方法  38
  4 结果  38-45
    4.1 片仔癀对U2OS/ADM2细胞增殖抑制和促凋亡作用  38-42
    4.2 片仔癀联用浓度的确定  42-43
    4.3 片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞增殖的影响  43-44
    4.4 片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞凋亡的影响  44-45
  5 讨论  45-47
  6 小结  47-48
第三章 片仔癀逆转人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞耐药的机制  48-59
  1 研究目的  48
  2 实验材料  48
    2.1 细胞及细胞培养  48
    2.2 主要试剂  48
    2.3 主要实验仪器  48
  3 实验方法  48-50
    3.1 流式细胞术检测片仔癀对U2OS/ADM2细胞内Rh123蓄积的影响  48
    3.2 流式细胞术检测片仔癀对U2OS/ADM2细胞内ADM蓄积的影响  48-49
    3.3 RT-PCR检测Bcl-2、Bax、Survivin、MDR1mRNA的表达  49
    3.4 Western blot检测Bcl-2、Bax、Survivin、P-gp蛋白的表达  49-50
    3.5 统计学方法  50
  4 结果  50-56
    4.1 片仔癀对U2OS/ADM2细胞Bcl-2、Bax、Survivin表达的影响  50-51
    4.2 片仔癀对U2OS/ADM2细胞P-gp表达的影响  51-54
    4.3 片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞Bcl-2、Bax、Survivin mRNA表达的影响  54
    4.4 片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞P-gp表达的影响  54-56
  5 讨论  56-58
  6 小结  58-59
第四章 片仔癀对人骨肉瘤U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤的作用  59-70
  1 研究目的  59
  2 实验材料  59-60
    2.1 实验用裸鼠  59
    2.2 细胞株  59
    2.3 主要试剂  59
    2.4 主要仪器  59-60
  3 实验方法  60-62
    3.1 骨肉瘤裸鼠移植瘤模型的建立  60
    3.2 实验动物分组及干预措施  60
    3.3 绘制肿瘤生长曲线  60
    3.4 肿瘤抑制率  60-61
    3.5 标本处理  61
    3.6 HE染色  61
    3.7 原位末端标记(TUNEL)法检测细胞凋亡  61-62
    3.8 RT-PCR检测Bcl-2、Bax、MDR1 mRNA的表达  62
    3.9 统计学方法  62
  4 结果  62-67
    4.1 裸鼠移植瘤模型的建立  62
    4.2 片仔癀、片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤生长抑制作用  62-64
    4.3 片仔癀、片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤病理形态的影响  64
    4.4 片仔癀、片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤凋亡的影响  64-66
    4.5 片仔癀、片仔癀与ADM联用对U2OS/ADM2细胞裸鼠移植瘤Bcl-2、Bax MDR1mRNA表达的影响  66-67
  5 讨论  67-69
  6 小结  69-70
总结与分析  70-72
结论  72-73
参考文献  73-79
致谢  79-80
文献综述  80-85
  参考文献  83-85
作者简介  85-86

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 运动系肿瘤 > 骨骼肿瘤
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