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NuSAP1在肝细胞癌中的表达及其与肝细胞癌复发的关系

作　者: 张猛
导　师: 杨定华
学　校: 南方医科大学
专　业: 临床医学
关键词: 肝细胞癌 核仁纺锤体相关蛋白1 腺病毒E2启动子的激活因子1 免疫组化、荧光定量PCR 复发转移
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


背景肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见、高发的恶性肿瘤之一肝细胞癌术后的高复发率成为影响其生存率和预后的最主要因素之一。但其根本的病因及机制尚不明了。深入研究原发性肝癌发生、发展的分子生物学基础,及早预测原发性肝癌复发的危险性,从而有效改善原发性肝癌病人的预后,在当前有着非常重要的现实意义。核仁纺锤体相关蛋白1(nucleolar spindle-associated protein1,NuSAP1)是一种微管合蛋白,在纺锤体组装中发挥重要功能,是保证细胞周期正常进行的重要调控分子。NuSAP1的mRNA水平和蛋白水平受到严格的调控,在细胞周期进程中呈现周期性变化。转录因子E2F家族在控制细胞周期的进展中起关键作用,NuSAP1基因的启动子区域含有E2F的结合位点,E2F1和E2F结合位点结合后可明显促进NuSAP1的转录。近年来研究发现在许多其它肿瘤中存在NuSAP1的过表达,它们的表达水平往往和肿瘤的侵袭性及预后有关。有关NuSAP1在原发性肝癌发生发展中的作用以及与肿瘤侵袭性、预后的关系还没有相关的报道。目的鉴于NuSAP1家族在细胞周期中的重要作用,其功能的紊乱与肿瘤的发生发展及转移复发可能存在着密切关系,本实验将从细胞水平和组织水平研究NuSAP1在肝细胞癌中的表达,分析NuSAP1在肝细胞癌中表达的临床意义及其与E2F1的关系,探讨NuSAP1在肝细胞癌的发生、发展和复发转移过程中的作用及其分子机制。方法(I).收集手术切除的新鲜肝细胞癌组织和相应的非癌组织标本,采用RT-PCR,荧光定量PCR检测癌和非癌组织标本中NuSAP1的mRNA表达水平,免疫组织化学染色检测癌和非癌组织标本中NuSAP1、E2F1蛋白表达水平,分别分析NuSAP1、E2F1在肝细胞癌中的表达与相关临床病理特征及预后的关系；并探讨E2F1在肝细胞癌中的表达及其与NuSAP1表达的关系。(11).采用人高转移肝细胞癌细胞株HCCLM3,利用SiRNA定向抑制NuSAP1的表达,采用荧光定量PCR方法检测抑制前后HCCLM3细胞株中NuSAP1mRNA表达的变化；采用Western blotting方法检测抑制前后HCCLM3细胞株中NuSAP1蛋白表达的变化；使用Freshney计数板计量细胞数目的变化；MTS和Edu法检测细胞增殖活性的变化；transwell小室检测细胞迁移能力和细胞侵袭能力的变化：流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的变化；分析其表达对肝细胞癌细胞生物学特性的影响；(III).采用人高转移肝细胞癌细胞株MHCC97H,利用SiRNA定向抑制E2F1的表达；采用荧光定量PCR方法检测抑制前后MHCC97H细胞株中NuSAP1mRNA表达的变化；采用Western blotting方法检测抑制前后MHCC97H细胞株中NuSAP1蛋白表达的变化；研究在肝细胞癌细胞株中E2F1的表达对NuSAP1表达的调节作用。结果1.无论是核酸水平还是蛋白水平,NuSAP1在肝细胞癌组织中的表达均明显高于相应的非癌组织(P<0.05)。单因素分析表明：NuSAP1mRNA和蛋白的表达均与TNM分期、巴塞罗那分期、淋巴结转移、早期复发、有无癌栓和病理分化相关(P<0.05)；NuSAP1mRNA的表达与血清AFP相关,而NuSAP1蛋白的表达与肿瘤大小、肝硬化相关(P<0.05)；多因素逐步logistic回归分析表明：NuSAP1蛋白的表达是早期复发的独立影响因素(P<0.05)。生存分析表明NuSAP1在肝细胞癌组织中的高表达与肝细胞癌患者预后差相关(X2=5.939,P=0.015)。肝细胞癌患者术后的无瘤生存期与NuSAP1蛋白表达的高低相关(Kaplan-Meier, log-rank test, P<0.05)。2.E2F1蛋白在肝细胞癌组织中的表达明显升高(P<0.05)；肝细胞癌组织中的E2F1蛋白表达升高与病理分化、早期复发、TNM分期及巴塞罗那分期相关(P<0.05)；生存分析表明E2F1在肝细胞癌组织中的高表达也与肝细胞癌患者预后差相关(X2=8.952,P=0.003)。肝细胞癌患者术后的无瘤生存期也与E2F1蛋白表达的高低相关(Kaplan-Meier, log-rank test, P<0.05)。并且E2F1与NUSAP1蛋白的表达呈正相关的关系(P<0.05)；3.在肝细胞癌细胞株的抑制实验中,抑制HCCLM3细胞株NuSAP1的表达可明显降低肝细胞癌的细胞数目的增加、抑制细胞增殖活性、细胞移动性及细胞侵袭性、促进G2/M期转化、促进细胞凋亡等(P<0.05)；抑制MHCC97H细胞株E2F1的表达可明显降低NuSAP1的表达量(P<0.05)。结论1、NuSAP1在肝细胞癌组织中存在过表达,NuSAP1在肝细胞癌中的表达与肝细胞癌患者的早期复发有关,NuSAP1高表达者预后差。2、E2F1在肝细胞癌组织中的表达明显升高,并且与NuSAP1的表达存在正相关,影响肝细胞癌患者的预后。3、NuSAP1表达在肝细胞癌中可能起癌基因的作用：NuSAP1可能作为癌基因参与肝细胞癌的发生和发展。4、肝细胞癌细胞中NuSAP1的表达上调可能是通过E2F1介导的。

全文目录


摘要  3-7
ABSTRACT  7-13
前言  13-15
第一章 NuSAP1在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义  15-39
  摘要  15-16
  1 实验材料  16-21
  2 实验方法  21-26
  3 实验结果  26-36
  4 讨论  36-39
第二章 E2F1、NuSAP1在肝细胞癌中的表达及其相互关系  39-64
  摘要  39-40
  1 实验材料  40-44
  2 实验方法  44-50
  3 实验结果  50-61
  4 讨论  61-64
第三章 siRNA特异性沉默NuSAP1基因对人肝细胞癌细胞HCCLM3细胞体外生长的影响  64-106
  摘要  64-65
  1 实验材料  65-69
  2 实验方法  69-87
  3 实验结果  87-103
  4 讨论  103-106
第四章 siRNA特异性沉默E2F1基因对人肝细胞癌MHCC97H细胞中NuSAP1表达的影响  106-138
  摘要  106-107
  1 实验材料  107-110
  2 实验方法  110-127
  3 实验结果  127-136
  4 讨论  136-138
结论和展望  138-139
参考文献  139-144
综述  144-152
  参考文献  149-152
缩略词表  152-155
致谢  155-156
附件  156

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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