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差异表达的ANXA10对人原发性肝癌细胞株（HepG2）基因表达谱影响的研究

作　者: 赵清梅
导　师: 彭小东
学　校:
专　业: 肿瘤学
关键词: 慢病毒 膜联蛋白A10 数字基因表达谱
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


目的：1、构建人ANXA10过表达慢病毒并转染人肝癌细胞株HepG2。2、检测ANXA10过表达慢病毒对人肝癌细胞株HepG2基因表达谱的影响，初步阐明ANXA10在原发性肝癌发生和发展中的基因调控作用，为原发性肝癌发生发展中的关键基因及其信号转导途径研究打下基础，为肝癌基因治疗寻找新的途径和理想的靶点。方法：1、体外实验，构建携带GFP过表达慢病毒ANXA10，并将过表达慢病毒ANXA10以MOI=10转染人肝癌细胞株HepG2,分成实验组（LV-ANXA10组）和空白对照组。过表达慢病毒ANXA10的转染效率的确定是采用在荧光显微镜观察GFP表达，采用Illumina-Solexa测序比较两组细胞基因表达谱的差异，并采用qPCR验证相关的部分差异基因。2、体内实验，用胰酶消化处于对数期生长的HepG2细胞，制成单细胞悬液，取200ulHepG2细胞悬液（1×10~7个/ml）接种于裸鼠右侧腋下。于接种后1周左右开始成瘤，第24天时瘤体直径约1-2cm大小，采用拖颈方式处死裸鼠并取出瘤体，剪成1mm3大小，分别接种至16只雌性裸鼠（6-8周龄）右侧腋窝皮下，1周后瘤体直径约0.3-0.5cm大小，将裸鼠随机分为2组，命名为实验组（转染过表达慢病毒ANXA10）、空白对照组(PBS组)。实验组每只裸鼠给予过表达慢病毒ANXA10量为2×10~7TU（100ul）,空白对照组每只裸鼠给予100ul浓度为0.01mol/L的PBS；3h后再次注射一次。4周以后采用拖颈方式处死16只裸鼠，并取出裸鼠皮下瘤体。采用免疫组化检测部分差异基因的表达水平。结果：1、重组慢病毒ANXA10对人肝癌细胞株HepG2的数字基因表达谱有影响，通过对生物信息的分析，实验组与空白对照组比较，共有118个基因表达上调，12个基因表达下调。2、荧光定量PCR技术检测结果显示，实验组与空白对照组比较，实验组中VEGF、NDRG1、ATG4bmRNA表达明显下调，而HIF-1α mRNA表达上调，差异有统计学意义（P<0.05），与DGE的分析结果一致。3、免疫组化检测裸鼠皮下移植瘤结果显示：实验组较空白对照组的VEGF、NDRG1、ATG4b蛋白质表达明显下调；而HIF-1α蛋白质表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)，与qPCR分析结果一致，进一步证实HIF-1α、VEGF、NDRG1、ATG4b在转染过表达慢病毒ANXA10的HepG2细胞和HepG2细胞的差异表达。结论：1、过表达ANXA10基因对人肝癌细胞株HepG2基因表达谱有影响。2、过表达ANXA10基因对人肝癌发生、发展相关的细胞因子VEGF、NDRG1、ATG4b可能存在抑制效应，HIF-1α可能存在促进效应。

全文目录


摘要  3-5
ABSTRACT  5-8
目录  8-12
第1章 前言  12-14
第2章 材料与方法  14-23
  2.1 实验材料  14-15
    2.1.1 人肝癌细胞株 HepG2 细胞  14
    2.1.2 主要试剂和耗材  14-15
  2.2 实验方法  15-21
    2.2.1 人肝癌细胞株 HepG2 体外培养  15-16
    2.2.2 ANXA10 基因重组慢病毒的构建、鉴定  16
    2.2.3 过表达慢病毒 ANXA10 转染 HepG2 细胞  16-17
    2.2.4 RNA 提取、cDNA 文库构建及测序  17-18
    2.2.5 实时荧光定量 PCR 法检测 HepG2 细胞中的 ANXA10、HIF-1α、VEGF、NDRG1、ATG4b 的 mRNA 表达水平  18-20
    2.2.6 人肝癌裸鼠皮下移植瘤模型的建立及过表达慢病毒 ANXA10 转染裸鼠皮下移植瘤  20
    2.2.7 免疫组化检测肿瘤组织中 ANXA10、HIF-1α、VEGF、NDRG1、ATG4b 的表达  20-21
  2.3 统计学分析  21-23
第3章 结果  23-39
  3.1 重组慢病毒转染效率检测  23
  3.2 数字基因表达谱的结果  23-29
    3.2.1 RNA 质量控制结果  23-24
    3.2.2 DGE 文库分析  24-27
    3.2.3 Clean Tag 对比分析  27-28
    3.2.4 差异基因表达分析  28-29
  3.3 荧光定量 PCR 结果  29-32
  3.4 差异基因的 GO 功能和 Pathway 富集分析  32-35
  3.5 免疫组化结果  35-39
第4章 讨论  39-44
  4.1 膜联蛋白 A10  39-40
  4.2 数字基因表达谱  40
  4.3 肝癌发生及发展的几个相关因子  40-44
第5章 结论  44-45
致谢  45-46
参考文献  46-51
攻读学位期间的研究成果  51-52
综述  52-57
  参考文献  56-57

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 消化系肿瘤 > 肝肿瘤
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