EGFR基因突变检测可以有效预测EGFR-TKI类药物的临床疗效,但临床中因肿瘤组织取材困难限制了EGFR基因突变的检测。研究发现肺癌患者循环血中游离DNA含量显著高于正常人,并且与原发肿瘤组织具有高度的遗传一致性,因此探索" />

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肺癌患者血清EGFR基因突变检测方法的比较

作　者: 秦岭
导　师: 陆慰萱
学　校: 北京协和医学院
专　业: 临床医学
关键词: 肺癌血清 EGFR基因突变方法比较引物延伸 DHPLC EGFR T790M 突变基因测序变性高效液相色谱 K-ras基因
分类号: R734.2
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

背景：研究表明肺癌组织的EGFR基因突变的学位论文">EGFR基因突变检测可以有效预测EGFR-TKI类药物的临床疗效,但临床中因肿瘤组织取材困难限制了EGFR基因突变的检测。研究发现肺癌患者循环血中游离DNA含量显著高于正常人,并且与原发肿瘤组织具有高度的遗传一致性,因此探索灵敏高效的检测方法对循环血基因组EGFR基因突变的检测至关重要。目的：比较 DHPLC法、基因测序法和Dxs EGFR29mutations Kit法对肺癌患者外周循环血血清的EGFR外显子19和21基因突变的检测结果,寻找一种准确度高、灵敏性好、操作方便的检测方法。方法：收集晚期肺癌患者血清87份,采用DHPLC法检测EGFR外显子19和21基因突变并用测序或克隆测序法验证；同时采用基因测序法对血清的EGFR外显子19和21的基因突变进行检测。收集周南等采用Dxs EGFR29mutations Kit法检测EGFR基因突变的血清49份,同时采用DHPLC法和基因测序法检测EGFR外显子19和21的基因突变。应用SPSS13.0软件,卡方检验分析三种方法对EGFR突变检出率的差异。结果：采用DHPLC法和基因测序法检测87例晚期肺癌患者血清的EGFR外显子19和21基因突变,DHPLC法的突变率35.63%(31/87)较测序法的突变率4.59%(4/87)高,且具有统计学差异(P<0.01)。血清中EGFR的突变与性别、年龄和吸烟无明显相关性。肺腺癌的突变率高于其他类型肺癌。本研究的DHPLC、基因测序二种方法和周南等的Dxs EGFR29mutations Kit法对49份血清EGFR19和21外显子基因突变的检测结果均为阴性。结论：与测序法相比,DHPLC可以较为灵敏准确地对晚期肺癌患者血清的EGFR基因突变进行检测,且操作方便,可作为EGFR突变的初筛方法。上述三种方法对早期肺癌患者血清EGFR基因突变检测结果均为阴性,可能与血清突变基因含量较少有关,需探索更加灵敏的检测技术。目的：建立一种检测EGFR20外显子T790M点突变的方法。方法：提取NSCLC突变细胞系H1975(含T790M点突变)的基因组DNA和正常人的基因组DNA,PCR分别扩增H1975细胞系基因组和正常基因组的EGFR exon20序列,针对该T790M突变点上游5’端序列设计并合成用于延伸反应的引物,利用“双脱氧核酸末端终止”的原理,在含有ddCTP和ddTTP的体系中进行引物延伸反应,用变性高效液相色谱法在80℃完全变性条件下检测延伸产物。结果：H1975细胞的延伸产物中能够检测到ddTTP的延伸产物(保留时间4.0min),而正常基因组的延伸产物中仅能检测到ddCTP的延伸产物(保留时间3.5min)。结论：本研究所建立的引物延伸-变性高效液相色谱联合法能够检测出突变细胞中EGFR20外显子T790M点突变,灵敏度高,有望应用于循环血基因组基因突变的检测。目的：利用基因测序和变性高效液相色谱法(DHPLC)检测K-ras基因突变方法：培养含K-ras第12密码子点突变的SW480细胞株和无突变的细胞株,提取基因组DNA,扩增突变型和野生型K-ras exonl基因片段,突变型和野生型基因按1：1比例混匀,变性复性后进行DHPLC检测；同时配制含K-ras突变基因比例分别为5%、10%、20%、25%的四种溶液,进行基因测序,以检测测序法的灵敏度。结果：DHPLC在不同的变性温度下未能区分野生型和突变型的K-ras基因；直接测序法能够检测到突变型K-ras的突变峰,但需要突变基因的含量大于20%。结论：DHPLC暂不适于本研究中PCR扩增的K-ras目的片段的突变检测,需要进一步改进检测技术；DNA测序法特异性好,但灵敏度低,不适于检测含微量突变的血清或血浆样本。

全文目录

英文缩略语  4-5
第一部分  5-29
  摘要  5-7
  Abstract  7-8
  引言  8-11
  材料与方法  11-17
  结果  17-25
  分析与讨论  25-27
  参考文献  27-29
第二部分  29-43
  摘要  29-30
  Abstract  30-31
  引言  31-33
  材料与方法  33-36
  结果  36-39
  分析与讨论  39-41
  参考文献  41-43
第三部分  43-53
  摘要  43-44
  Abstract  44-45
  引言  45-46
  材料与方法  46-47
  结果  47-50
  分析与讨论  50-51
  参考文献  51-53
课题综述  53-64
  参考文献  60-64
致谢  64

肺癌患者血清EGFR基因突变检测方法的比较

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