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两种骨髓间充质干细胞对K562细胞生长调控的不同作用及机制

作　者: 徐铮
导　师: 罗建民
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 骨髓间充质干细胞 K562细胞细胞共培养 Toll样受体通路经典Wnt/β-catenin通路
分类号: R733.72
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

目的：与实体肿瘤相同，血液肿瘤的发生发展的始动因素同样是原癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活。但与实体肿瘤不同的是，血液肿瘤的生长增殖发生在一个精密而复杂的调控系统——造血微环境中。正常情况下，造血微环境中具有调控活性的基质细胞通过合成和释放造血因子和造血抑制因子来调控血细胞的生长，并维持血细胞在不同阶段的正常形态。作为一种起源于多功能造血干细胞的恶性克隆性疾病，慢性髓细胞白血病（chronic myelocytic leukemia CML）通常以外周血白细胞的异常增高，CML白血病细胞以中性中、晚幼粒及成熟粒细胞、嗜酸粒细胞、嗜碱粒细胞增多等为特征。相较于正常骨髓象和血象，CML的这一系列变化恰恰说明CML肿瘤细胞的生殖和分化打破了正常的造血调控的平衡，提示我们CML患者的骨髓造血微环境发生了异常变化。为了研究骨髓造血微环境对CML肿瘤细胞的增殖是促进还是抑制，我们选取骨髓间充质干细胞（bone marrow derived mesenchymal stem cell,BMMSCs）在体外模拟造血微环境中的骨髓基质细胞，因为BMMSCs是造血微环境中基质细胞的干细胞，可以分化成各类基质细胞，并能分泌多种细胞因子参与骨髓造血的调控。在我们以往的研究中发现，Toll样受体通路中的TAB1、TBK1、MAPK11、CXCL10等基因在CML慢性期和急变期白血病细胞中的表达量存在着显著差异，而这种差异是否在CML白血病细胞的产生和增殖过程中起着重要的调控作用尚不清楚。为了很好的探索这一问题，我们选用健康人来源的人骨髓间充质干细胞株（Human Mesenchymal Stem Cell-bone marrow，HMSC-hm）和CML慢性期初治患者来源的骨髓间充质干细胞在体外分别模拟健康人的骨髓微环境和CML患者的骨髓微环境，以K562细胞株模拟CML白血病细胞，采用K562细胞与骨髓间充质干细胞共培养的方式，构建出一个类似人体骨髓造血微环境对CML白血病细胞调控的模型，通过绘制K562细胞生长曲线，检测共培养细胞的上清液中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α等细胞因子，比较不同方法培养的骨髓间充质干细胞TAB1、TBK1和NF-κB基因及蛋白产物表达情况的不同，比较不同方法培养的K562细胞中β-catenin基因及蛋白产物表达情况的不同，对骨髓间充质干细胞对K562细胞生长调控的不同影响以及Toll样受体通路在该调控过程中可能的作用机制进行了初步探讨。方法：1第一部分：比较慢性髓细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞株对K562细胞增殖的不同作用（1）分组，以K562细胞与慢性髓细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞（CML-BMMSCs）共培养组为实验组一，K562细胞与健康人骨髓间充质干细胞共培养组（HMSC-hm）为实验组二，以K562单独培养组为对照组。（2）CCK8法绘制K562细胞生长曲线。（3）流式细胞术检测K562细胞凋亡。2第二部分：两种BMMSCs的NF-κB、TAB1和TBK1基因和蛋白产物以及受其调控的细胞因子IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α表达水平的比较（1）分组，以CML-BMMSCs细胞和K562细胞共培养组为实验组一，以HMSC-hm细胞和K562细胞共培养组为实验组二，以CML-BMMSCs细胞单独培养组为对照组一，以HMSC-hm细胞单独培养组为对照组二。（2）RT-PCR检测TAB1基因、NF-κB基因和TBK1基因在四组骨髓间充质干细胞（BMMSCs）中的表达情况。（3）蛋白质印迹法（Western blot）检测TAB1、NF-κB和TBK1蛋白产物在四组BMMSCs中的表达情况。（4）以酶联免疫吸附试验检测和比较各组IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α细胞因子分泌水平。3第三部分：两种骨髓间充质干细胞影响K562细胞株经典Wnt/β-catenin信号途径活性的初步研究（1）分组，以K562细胞与CML-BMMSCs细胞共培养组为实验组一，以K562细胞与HMSC-hm细胞共培养组为实验组二，以K562单独培养组为对照组一，以重组人干扰素α2b处理72小时的K562细胞为对照组二。（2）RT-PCR检测β-catenin基因在四组K562细胞中的表达情况。（3）Western blot检测β-catenin蛋白在四组K562细胞中的表达情况。结果：1三组K562细胞生长曲线表明，0h到48h之间三组K562细胞生长均较为缓慢，48h至72h，三组K562细胞增殖开始加速，但实验组二K562细胞生长较其它两组相对缓慢，差异存在显著性（P<0.05），表明其增殖受到一定程度的抑制，而实验组一与对照组的K562增殖速度不存在显著差异（P>0.05）。2流式细胞仪检测培养72h后的三组K562细胞，其早期凋亡细胞+晚期凋亡细胞的结果如下：实验组一1.52±0.10，实验组二13.33±7.68，对照组2.46±0.88。实验组二最高，与实验组一及对照组存在十分显著的差异（P<0.01）。实验组一和对照组不存在显著性差异(P>0.05)。3四组骨髓间充质干细胞NF-κB、TAB1和TBK1的RT-PCR检测结果（1）NF-κB/β-actin mRNA表达值为：实验组一0.0402±0.0024，实验组二0.0196±0.0025，对照组一0.0214±0.0028，对照组二0.0188±0.0036。实验组一最高，与实验组二、对照组一及对照组二相比均存在显著的差异（P<0.05）；实验组二与对照组一及对照组二相比均不存在显著的差异（P>0.05）；对照组一与对照组二相比差异性不显著（P>0.05）。（2）TAB1/β-actin mRNA表达值为：实验组一0.0319±0.0086，实验组二0.0224±0.0051，对照组一0.0252±0.0030，对照组二0.0134±0.0046。其中，其中，实验组一、实验组二及对照组一两两比较差异均不显著（P>0.05），但三组与对照组二两两比较均存在显著的差异（P<0.05）。（3）TBK1/β-actin mRNA表达值为：实验组一0.0406±0.0080，实验组二0.0584±0.0094，对照组一0.0504±0.0091，对照组二0.0614±0.0130。其中，对照组二最高，与实验组一相比较差异性显著（P<0.05），但与实验组二及对照组一相比较均无显著差异（P>0.05）；实验组一、实验组二和对照组二两两比较均不存在显著差异（P>0.05）。4四组骨髓间充质干细胞NF-κB、TAB1和TBK1蛋白产物Western blot检测结果（1）四组骨髓间充质干细胞均能表达NF-κB蛋白，但对照组二与其它三组相比较已经明显收窄。Quantity One图像分析软件分析NF-κB蛋白条带的光密度值结果及其柱状图表明，NF-κB蛋白浓度由高到低依次为实验组一、对照组一、实验组二和对照组二。（2）四组骨髓间充质干细胞均能表达TAB1蛋白，但对照组二的蛋白条带较其它三组条带明显收窄。使用Quantity One图像分析软件分析TAB1蛋白条带的光密度值，可知TAB1蛋白浓度由高到低依次为实验组一、、对照组一、实验组二和对照组二。（3）四组骨髓间充质干细胞均能表达TBK1蛋白，其中实验组一和对照组一的蛋白条带较窄，实验组二和对照组二较宽。使用Quantity One图像分析软件分析TAB1蛋白条带的光密度值，可以得出TBK1蛋白浓度由高到低依次为实验组二、对照组二、对照组一和实验组一。5四组细胞上清液中IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-α的ELISA法检测结果（1）IL-6OD450值，实验组一23.75±1.32，实验组二25.21±0.30，对照组一16.47±0.94，对照组二14.62±0.92。实验组二最高，与两个对照组相比均存在显著差异（P<0.05），但与实验组一不存在显著差异（P>0.05）。实验组一与两个对照组同样存在显著差异（P<0.05）。两个对照组相比也存在显著差异（P<0.05）。（2）IL-8OD450值，实验组一1269.28±4.12，实验组二6022.64±134.71，对照组一66.26±11.56，对照组二127.26±4.49。实验组二最高，与其它三组均存在显著的差异（P<0.01）。实验组一与两个对照组均存在十分显著的差异（P<0.01）。CML-BMMSCs两个对照组之间则无显著差异（P>0.05）。（3）TNF-α OD450值，实验组一32.17±0.83，实验组二36.33±7.03，对照组一50.79±4.01，对照组二44.17±3.09。对照组一最高，与对照组二无显著性差异（P>0.05），但与两个实验组相比存在显著的差异（P<0.05）。对照组二与两个实验组也存在显著性差异（P<0.05）。两个实验组之间差异无显著性（P>0.05）。（4）IFN-α OD450值，实验组一27.73±2.83，实验组二40.11±0.61，对照组一37.93±1.86，对照组二53.66±4.29。对照组二最高，与其它三组比较均存在显著性差异（P<0.05）。两个实验组相比差异有显著性（P<0.05）。实验组二与对照组一相比差异无显著性（P>0.05）。实验组一与对照组一相比存在显著性差异（P<0.05）。6四组K562细胞β-catenin/β-actin mRNA表达值分别为：实验组一0.0130±0.0025、实验组二0.0097±0.0020、对照组一0.0265±0.0042、对照组二0.0096±0.0027。其中，对照组一最高，与实验组一、实验组二及对照组二相比较均存在显著差异（P<0.05）；实验组一、实验组二和对照组二两两相互比较差异性均不显著（P>0.05）。7β-catenin蛋白的Western blot检测结果表明，四组骨髓间充质干细胞均能表达β-catenin蛋白。采用Quantity One图像分析软件分析β-catenin蛋白条带的光密度值，得出β-catenin蛋白浓度由高到低依次为：对照组一、实验组一、实验组二和对照组二。结论：1健康人来源的HMSC-hm对K562细胞的生长具有一定的抑制作用，慢性髓系白血病患者来源的CML-BMMSCs不能抑制K562细胞的生长。2两种BMMSCs对K562细胞的不同作用可能是通过调控Toll样受体通路活性来实现的。HMSC-hm通过下调IL-6和IL-8等细胞因子分泌以及上调TNF-α和IFN-α等细胞因子的分泌介导对K562细胞生长的抑制；相反地，CML-BMMSCs释放大量IL-6和IL-8等细胞因子促进细胞生长，同时下调TNF-α和IFN-α等抑制K562细胞生长的细胞因子的分泌。3两种BMMSCs均可抑制K562细胞Wnt经典通路上核心的β-catenin基因及其蛋白的活性。

全文目录

摘要  5-10
ABSTRACT  10-18
英文缩写  18-20
引言  20-23
第一部分比较慢性髓细胞白血病患者的骨髓间充质干细胞与人骨髓间充质干细胞株对 K562 细胞增殖的不同作用  23-40
  前言  23-24
  材料与方法  24-27
  结果  27-29
  附图  29-33
  附表  33-34
  讨论  34-35
  小结  35
  参考文献  35-40
第二部分两种 BMMSCs 的 NF-κB、TAB1 和 TBK1 基因和蛋白产物以及受其调控的细胞因子 IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-α表达水平的比较  40-73
  前言  40-41
  材料与方法  41-53
  结果  53-56
  附图  56-63
  附表  63-68
  讨论  68-70
  小结  70
  参考文献  70-73
第三部分两种骨髓间充质干细胞影响 K562 细胞株经典 Wnt/β-catenin信号途径活性的初步研究  73-95
  前言  73
  材料与方法  73-86
  结果  86-87
  附图  87-90
  附表  90-91
  讨论  91-93
  小结  93
  参考文献  93-95
结论  95-96
综述 Toll 样受体通路及其对肿瘤生长促进作用的研究进展  96-104
  参考文献  101-104
致谢  104-105
个人简历  105

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