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基于核酸适配体的肿瘤细胞高灵敏电化学检测

作　者: 曲丽明
导　师: 彭睿
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 肿瘤细胞核酸适配体修饰电极电化学检测
分类号: R730.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康,其致死的主要原因是肿瘤细胞可以从原发位点脱离,进入血液或淋巴循环,形成循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTC),并在别处形成新的肿瘤位点。由于循环肿瘤细胞在生理样本中含量低,样本复杂度高,难以在早期被检测出来,延误了最佳治疗时机,所以提高检测的灵敏度以降低假阴性,增强特异性以降低假阳性尤为重要。核酸适配体是通过体外筛选得到的寡核苷酸片段,可以和相应的配体高特异性、高亲和性地结合；而电化学检测具有快速简便、灵敏度高等优点。本论文主要研究了利用肿瘤细胞特异性的核酸适配体修饰电极,并通过逐步优化,显著降低了检测的背景值,提高了灵敏度,实现了对肿瘤细胞高特异性、高灵敏的快速检测。首先将BNL1MEA.7R.1(MEAR)肝癌细胞特异的核酸适配体TLS1c由T15寡核苷酸连接分子(ss linker)共价修饰到玻碳电极表面,利用循环伏安法(CV)、差分脉冲伏安法(DPV)及交流阻抗法(EIS)对MEAR细胞进行检测。结果显示,TLSlc可以有效的修饰到电极表面,实现对MEAR细胞特异性检测。为了降低检测背景值,我们首先对检测样品进行了预处理：将外周血离心处理,去除血浆,降低样本复杂度。然后将TLS1c由双链连接分子(ds linker)共价修饰到电极表面。相比于ss-TLS1c修饰电极,ds-TLS1c修饰电极显著的降低了检测的背景值,提高了检测的灵敏度。此外,利用DPV对不同数目的肿瘤细胞进行检测。结果表明,DPV的峰电流随阳性细胞数量的增加而增加。峰电流值与阳性细胞数量呈现很好的线性关系,可以实现对肿瘤细胞的定量检测。为了进一步提高捕获肿瘤细胞的机会,将两个特异识别MEAR细胞的核酸适配体TLS1c和TLS11a分别由单链和双链连接分子双修饰到电极表面。结果表明,ss-TLS1c/ds-TLS11a双修饰电极具有最低的背景值和最好的检测限。在1mL含有109个全血细胞中,可以实现对低至一个MEAR细胞的痕量检测。

全文目录

中文摘要  4-5
Abstract  5-10
第一章绪论  10-27
  1.1 引言  10
  1.2 CTC检测方法  10-12
    1.2.1 细胞计数法  11
    1.2.2 以核酸为基础的检测方法  11-12
    1.2.3 富集和检测相结合的检测方法  12
  1.3 核酸适配体(APTAMER)及其优点  12-14
    1.3.1 指数富集配体系统进化技术(Systematic evolution of ligand byexponential enrichment,SELEX)  12-13
    1.3.2 cell-SELEX  13
    1.3.3 核酸适配体的优点  13-14
  1.4 APTAMER在临床中的应用  14-16
    1.4.1 分子影像  14
    1.4.2 肿瘤靶点研究  14-15
    1.4.3 生物传感器  15
    1.4.4 药物运输和治疗  15-16
  1.5 电化学检测  16-18
    1.5.1 循环伏安法  16-17
    1.5.2 交流阻抗法  17
    1.5.3 差速脉冲伏安法  17
    1.5.4 阳极溶出伏安法  17-18
  1.6 基于APTAMER的电化学检测  18-20
    1.6.1 标记型电化学核酸适配体传感器  18-19
    1.6.2 非标记型电化学核酸适配体传感器  19-20
  1.7 本课题的立题依据、意义和研究内容  20-21
    1.7.1 立题依据、意义  20-21
    1.7.2 研究内容  21
  参考文献  21-27
第二章单核酸适配体修饰电极用于肿瘤细胞早期检测  27-41
  2.1 引言  27-29
  2.2 实验材料  29
    2.2.1 实验试剂  29
    2.2.2 细胞株  29
  2.3 实验方法  29-31
    2.3.1 电化学传感器的组装  29-30
    2.3.2 电极修饰的优化  30
    2.3.3 样品预处理  30
    2.3.4 TLS1c识别MEAR靶向细胞  30
    2.3.5 电化学检测  30-31
  2.4 结果与讨论  31-36
    2.4.1 检测原理简述  31
    2.4.2 电化学传感器的组装  31-33
    2.4.3 电极组装的优化  33
    2.4.4 电极封闭及优化  33-34
    2.4.5 TLS1c特异识别MEAR靶向细胞  34-35
    2.4.6 TLS1c修饰电极的灵敏度  35-36
  2.5 结论  36
  参考文献  36-41
第三章双核酸适配体修饰电极用于肿瘤细胞的灵敏检测  41-54
  3.1 引言  41-42
  3.2 实验材料  42-43
    3.2.1 实验试剂  42-43
    3.2.2 实验仪器  43
    3.2.3 细胞株  43
  3.3 实验方法  43-45
    3.3.1 竞争结合实验  43-44
    3.3.2 TLS1c和TLS11a功能化电极的组装  44
    3.3.3 TLS1c和TLS11a识别血液中的MEAR细胞  44
    3.3.4 电化学检测  44-45
  3.4 结果与讨论  45-50
    3.4.1 TLS1c和TLS11a识别同一个生物靶标  45-47
    3.4.2 电极组装的设计  47
    3.4.3 检测原理简述  47-48
    3.4.4 ss-TLS1c/ds-TLS11as双修饰电极对血液中MEAR细胞的高灵敏检测  48-49
    3.4.5 ss-TLS1c/ds-TLS11a双修饰电极具备最低的背景信号以及最高的灵敏度  49-50
  3.5 结论  50-51
  参考文献  51-54
第四章总结  54-56
攻读硕士学位期间的科研成果  56-57
致谢  57

基于核酸适配体的肿瘤细胞高灵敏电化学检测

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