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MARVELD1线粒体信号肽的确认及与Hsp70相互作用研究

作　者: 邹宇宁
导　师: 李钰
学　校: 哈尔滨工业大学
专　业: 生物学
关键词: MARVELD1 线粒体 信号肽 定位 Hsp70
分类号: R730.231
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要


MARVELD1(MARVEL domain containing1)基因定位于人类10q24.2，编码mRNA全长3238bp，本实验室早期研究发现其编码的蛋白在细胞中有内源性表达，并在多种肿瘤组织中都出现了明显的表达下调。信号肽预测分析结果显示MARVELD1蛋白N-末端1-33位氨基酸可能为其线粒体定位信号肽序列。课题组前期通过胶体金免疫电镜对该蛋白的定位情况进行研究，结果显示在线粒体中存在MARVELD1蛋白的分布。本课题的研究试图通过确认MARVELD1假定线粒体信号肽与MARVELD1在线粒体中定位的关系及其相互作用的分子，深入认识MARVELD1在线粒体中的功能。本课题采用稳定表达野生型全长MARVELD1及其假定信号肽缺失截短体的肺癌细胞A549，结合免疫荧光及Western blotting分析。结果表明野生型MARVELD1存在较强的线粒体定位，而MARVELD1假定信号肽缺失截短体仍存在较弱的线粒体定位，说明该假定信号肽序列对于影响MARVELD1线粒体定位具有一定功能，但其缺失却并不能完全干扰MARVELD1进入线粒体。同时，本课题组前期采用GST-pull down结合质谱分析的方法筛选MARVELD1的相互作用分子时发现，MARVELD1与Hsp70存在潜在相互作用。基于以上结果，本课题应用Co-IP技术，在稳定表达MARVELD1或假定信号肽缺失截短体的A549细胞中检测MARVELD1与Hsp70是否存在相互作用。结果显示野生型与截短体MARVELD1均与存在于细胞质中的Hsp70存在相互作用，而与线粒体中的Hsp70家族成员mtHsp70并不存在相互作用。本研究还通过线粒体组分分离结合质谱分析技术分析了MARVELD1在线粒体中的相互作用分子，结果发现MARVELD1可能与线粒体加工肽酶存在相互作用。

全文目录


摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章 绪论  8-17
  1.1 课题背景及研究的目的和意义  8
  1.2 国内外在该方向的研究现状及分析  8-15
    1.2.1 MAEVELD1 相关研究进展  8-9
    1.2.2 线粒体研究进展  9-15
    1.2.3 Hsp70 家族简介  15
  1.3 主要研究内容  15-17
第二章 材料与方法  17-24
  2.1 实验材料  17-19
    2.1.1 材料  17
    2.1.2 重组体  17
    2.1.3 抗体  17-18
    2.1.4 实验试剂  18
    2.1.5 主要仪器设备  18-19
    2.1.6 主要软件  19
  2.2 实验方法  19-23
    2.2.1 培养细胞的线粒体组分分离  19-20
    2.2.2 培养细胞的稳定转染及克隆筛选  20-21
    2.2.3 免疫荧光  21
    2.2.4 免疫共沉淀  21-22
    2.2.5 胶内酶切  22-23
  2.3 本章小结  23-24
第三章 重组体细胞转染及线粒体组分分离  24-28
  3.1 引言  24
  3.2 稳定表达截短体蛋白的 A549 细胞的获得  24-26
  3.3 线粒体提取及裂解方式的确立  26-27
  3.4 本章讨论  27
  3.5 本章小结  27-28
第四章 MARVELD1 线粒体信号肽的确认  28-35
  4.1 引言  28
  4.2 MARVELD1 在 A549 细胞线粒体中的定位分析  28-31
    4.2.1 免疫荧光检测 MARVELD1 在线粒体中的定位情况  28-29
    4.2.2 Western blotting 分析 MARVELD1 在细胞线粒体中的表达  29-31
  4.3 MARVELD1 假定信号肽缺失截短体在线粒体中的定位分析  31-33
    4.3.1 免疫荧光分析 MARVELD1 假定信号肽缺失截短体定位情况  31-32
    4.3.2 Western blotting 分析 MARVELD1 假定信号肽缺失截短体的定位  32-33
  4.4 本章讨论  33-34
  4.5 本章小结  34-35
第五章 MARVELD1 与 Hsp70 及线粒体蛋白相互作用的分析  35-40
  5.1 引言  35
  5.2 MARVELD1 与 Hsp70、mtHsp70 相互作用分析  35-36
    5.2.1 MARVELD1 与 Hsp70 相互作用分析  35-36
    5.2.2 MARVELD1 与 mtHsp70 相互作用分析  36
  5.3 MARVELD1 在线粒体中相互作用分子的筛选  36-38
  5.4 本章讨论  38-39
  5.5 本章小结  39-40
结论  40
展望  40-41
参考文献  41-47
致谢  47

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