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ION-CCI大鼠TG和TNC BKca通道的变化及机制研究

作　者: 卢占英
导　师: 马蓓
学　校: 第二军医大学
专　业: 生理学
关键词: BKca通道三叉神经节神经病理性痛 NS1619 ERK p38
分类号: R745.11
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

【研究目的】三叉神经痛是神经病理性痛之一，其疼痛剧烈难忍，易复发，存在扳机点，长期以来被医学界所重视。然而由于其发病机制尚不完全清楚，到目前为止，临床上仍缺乏满意的治疗药物。已有的研究表明神经病理性痛和炎症痛发生时，BKca通道mRNA和蛋白质在DRG、TG和TNC神经元上表达均显著降低；BKca激动剂NS1619，可使TNC神经元静息电位超极化，显著地降低了动作电位爆发的频率和幅度，显著逆转L5-L6脊神经结扎所引起的神经病理性痛。而关于三叉神经病理性痛发生时BKca通道的变化，尚未见报道。MAPK家族包括ERK、p38和JNK,在细胞信号转导和基因表达过程中发挥重要的作用，有研究表明神经病理性痛发生时，TG、脊髓背角神经元ERK磷酸化增加，引起痛觉异常，而用拮抗剂抑制ERK磷酸化可以减轻痛觉异常；p38拮抗剂可以阻断TNFα对脊髓背角GABA能神经元自发放电频率的抑制作用，抑制损伤介导的GABA1受体的下调，从而产生镇痛作用；降低JNK1磷酸化，可使炎性因子分泌降低，抑制SNL介导的神经病理性痛。关于在三叉神经病理性发生时MAPK磷酸化调节是否参与其中，并且BKca通道的变化是否受MAPK磷酸化调节尚未见报道，因此本课题运用痛觉行为学、免疫组织化学、分子生物学和全细胞膜片钳记录方法从整体和细胞水平研究BKca通道在三叉神经病理性痛中的变化及其磷酸化调节（p-ERK、p-p38、p-JNK和p-Akt）机制。为进一步阐明三叉神经病理性痛的发病机制提供依据，为寻找新的镇痛靶点和治疗方法打下基础。【研究方法】1.动物分组首先对雄性SD大鼠（200-250g）进行筛选，对面部机械痛阈≧14.9g的大鼠随机分成两组，一组构建三叉神经病理性痛模型（ION-CCI模型），一组进行假手术。2.三叉神经病理性痛模型建造（ION-CCI手术）2%戊巴比妥钠行腹腔注射（50mg/kg体重）麻醉。沿大鼠右颊部颧骨下缘距鼻背部约0.5cm，做长约0.5cm切口，钝性分离，暴露眶下神经。从近端向远端分离约4~5mm的长度。生物解剖镜下两根铬肠线（4-0）间距约2mm结扎眶下神经，力度适中。压迫标准：镜下可见结扎线使神经的直径略微变细，但不能完全阻断其传导且神经外膜的血液循环必须通畅。假手术组以同样方法暴露眶下神经，但不结扎。3.痛觉行为学测定使用弗莱毛测量术后大鼠面部机械痛阈，从细到粗，每个力度的弗莱毛刺激右侧面部触须垫部位10次，以大鼠有躲闪、逃避、攻击等相关疼痛反应行为记为阳性，10次中有6次或者6次以上记录为阳性时，认为此时弗莱毛相对应的克数即为大鼠面部机械痛阈值。对于ION-CCI大鼠面部机械痛阈≦2g的确定造模成功；比较研究BKca激动剂NS1619、ERK拮抗剂U0126、p38拮抗剂SB203580、JNK拮抗剂SP600125和Akt拮抗剂LY294002分别对假手术和ION-CCI大鼠面部机械痛阈的影响。4.免疫组织化学假手术和ION-CCI大鼠重度麻醉后进行生理盐水灌注，当血液冲洗干净后用300ml4%多聚甲醛灌流，取出TG和TNC，分别放入4%多聚甲醛后固定4h，放入30%蔗糖溶液脱水，待组织块在30%蔗糖溶液中沉入底部后，用0.01MPBS缓冲液漂洗，制做冰冻切片，室温封闭，抗原暴露，0.01MPBS缓冲液漂洗3×3min，神经元标记物NeuN一抗分别和BKca、p-ERK、p-Akt一抗、损伤神经元的标记物ATF3一抗4℃孵育过夜，0.01MPBS缓冲液漂洗3×3min，在室温条件下分别孵育相应二抗，0.01MPBS缓冲液漂洗3×3min，封片，荧光显微镜下观察。5.全细胞膜片钳记录假手术和ION-CCI大鼠轻度麻醉后断头处死，急性分离培养大鼠TG神经元，运用全细胞膜片钳分别记录假手术和ION-CCI大鼠TG神经元动作电位和BKca电流，比较假手术组和ION-CCI组TG神经元电特性（动作电位阈电流强度、时程、幅值和后超极化幅值）的改变，BKca电流的变化和ERK拮抗剂U0126、p38拮抗剂SB203580、JNK拮抗剂SP600125和Akt拮抗剂LY294002分别对BKca电流的影响。6.RT-PCR测定（1）RNA分离和cDNA合成大鼠断头致死后，迅速取出TG和TNC，用Trizol提取液提取总RNA，紫外分光光度计测RNA纯度（A260/280），同时行RNA定量。提取的RNA中，每样本2μl在20μl体系中反转录成cDNA，-20℃保存，用于实时定量聚合酶链式反应扩增BKca通道基因。（2）RT-PCR用于扩增BKca通道α基因的引物对为：AGGAATGCATCTTGGCGTCACTC（正义）,CCTCGAAGTGCATTCTCCTCAGC（反义）；反应条件为：94℃，5min；94℃，35s；58℃，90s；72℃，90s。用于扩增BKca通道β1基因的引物对为：ATGGAGGCTCAACCCAGATGG（正义），CCCATCTGCCCACAGCTGATA（反义），β2基因的引物对为：ACTGCTGCGCTCGTACATGCA（正义），CGTTGGCCAGAAGAGAGAATGGA（反义）；β3基因的引物对为GGCTGTAGAACCACCCAAGTC（正义），TCTTCTCTGGGAGAGCTGAC（反义）；β4基因的引物对为CGAAGCTCAGGGTGTCTTACG（正义），CAGTGCAGGAGGACAATCTCG（反义），β1、2、3、4基因反应条件均同α基因；β-actin基因的引物对为ATGGTGGGTATGGGTCAGAAG（正义），TGGCTGGGGTGTTGAAGGTC（反义），反应条件为：95℃，2min；95℃，20s；58℃，25s；72℃，25s。7.Westernblot大鼠轻度麻醉后断头致死，迅速取出TG和TNC，用RIPA蛋白裂解液迅速裂解蛋白，匀浆，BSA法紫外分光光度计（wave595）测蛋白浓度，同时行蛋白定量。提取的样本中，每次取60μg蛋白上样电泳，恒压120V电泳90min，随后恒流300mA转膜120min，脱脂牛奶封闭，洗膜，BKca、p-ERK、p-Akt一抗孵育4℃过夜，隔天洗膜，常温孵育BKca、p-ERK、p-Akt二抗60min，显影拍照，测量灰度并统计分析。【结果】1.痛觉行为学测定，与假手术大鼠相比，ION-CCI大鼠面部机械痛阈显著下降。运用眶下孔注射方法，对术后第15天的ION-CCI组大鼠，注射BKca通道激动剂NS1619100μg/100μl，可以显著增加ION-CCI大鼠面部痛阈，起到镇痛效应。2.免疫组织化学方法，研究表明ION-CCI大鼠与假手术大鼠相比TG和TNC神经元ATF3的表达显著增加、BKca表达明显下降，其中直径30-40μmTG神经元上BKca的表达显著降低，p-ERK在TG神经元上表达显著增加，而p-Akt表达无明显的变化。3.分别取术后第15天ION-CCI和Sham组大鼠TG和TNC，RT-PCR结果显示，BKca通道的组成性α亚基以及调节性的β2、β4亚基大量表达，而调节性的β1、β3亚基不表达。ION-CCI术后大鼠TG和TNC上BKca通道的α、β2、β4亚基在mRNA水平表达较Sham组均显著下降，Westernblot结果提示，ION-CCI术后大鼠TG和TNC上的BKca通道蛋白表达含量较Sham组显著下降，p-ERK在TG上表达显著增加，p-Akt表达没有明显改变。4.利用全细胞膜片钳记录神经元动作电位阈电流强度、幅值、时程和快速后超极化的幅值，与假手术组相比，ION-CCI组大鼠TG神经元动作电位阈电流显著下降，动作电位的幅值、时程没有明显的变化，快速后超极化的幅值显著降低。5.利用全细胞膜片钳记录假手术和ION-CCI大鼠TG神经元BKca电流，与假手术组相比，ION-CCI组BKca电流显著降低，对Paxilline敏感的BKca电流显著降低，对Paxilline不敏感的BKca电流没有明显的影响。6.痛觉行为学测定，与假手术大鼠相比，ERK拮抗剂U012610μg/20μl、p38拮抗剂SB20358010μg/20μl、JNK拮抗剂SP60012510μg/20μl和Akt拮抗剂LY294002100μg/20μl都可以显著提高ION-CCI大鼠面部痛阈，起到镇痛效应。7.全细胞膜片钳记录ERK拮抗剂U0126、p38拮抗剂SB203580、JNK拮抗剂SP600125和Akt拮抗剂LY294002分别对BKca电流的影响。结果显示，ERK拮抗剂U01261μM、p38拮抗剂SB20358010μM和30μM均可以显著增大ION-CCI组大鼠TG神经元BKca电流，而Akt拮抗剂LY294002、JNK拮抗剂SP60012510μM和100μM对ION-CCI组大鼠TG神经元BKca电流没有明显的影响。【结论】1.ION-CCI大鼠TG和TNCBKca表达降低、面部机械痛阈显著降低，BKca激动剂NS1619可以显著提高ION-CCI大鼠面部机械痛阈，起到镇痛效应。2.ERK拮抗剂U0126和p38拮抗剂SB203580均可显著增大TG神经元BKca电流，提高ION-CCI组大鼠面部机械痛阈，起到镇痛效应。TG和TNC神经元BKca表达显著降低，神经元兴奋性增高，参与了眶下神经慢性缩窄环术（ION-CCI）大鼠面部痛觉过敏和痛觉异常。这一过程可能与增强ERK及p38MAPK的磷酸化从而对BKca通道的抑制性调节有关。

ION-CCI大鼠TG和TNC BKca通道的变化及机制研究

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