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肝复康对肝纤维化大鼠肝组织及肝星状细胞凋亡相关蛋白的影响

作　者: 田甜
导　师: 贾玉杰
学　校: 大连医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 肝纤维化肝星状细胞 caspase 细胞色素C 肝复康
分类号: R575.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

研究目的：在肝纤维化的形成和逆转过程中，肝星状细胞的增殖和凋亡发挥着关键性作用,抑制活化的肝星状细胞增殖和诱导肝星状细胞凋亡，是治疗肝纤维化的重要措施之一。本研究从整体和离体两方面观察肝纤维化时肝组织及肝星状细胞凋亡相关蛋白的变化,并就中药肝复康对其影响进行研究，从而为肝纤维化的中药治疗提供实验依据。实验方法：整体实验：将SD大鼠随机分为正常对照组、模型组、中药治疗组（高、中、低剂量组）。对模型组和中药治疗组用橄榄油稀释的10%的四氯化碳对其进行皮下注射以制备肝纤维化模型，5ml/kg，2次/周，共90天。对正常对照组，注射物质由四氯化碳换成生理盐水，余方法同前。造模60天后开始用不同剂量的中药肝复康对大鼠进行灌胃给药治疗。所用剂量分别为高、中、低，即3125,312.5,31.25mg/kg/天，治疗时间为60天。所有大鼠均以标准饲料喂养，饮水活动自由。全部大鼠于最后一次给药的24小时后处死，迅速取大鼠肝左叶，对其进行分子生物学及组织学检测。离体实验：将HSC-T6细胞株放在37°C、5%CO2混合气体的孵箱中，用含青霉素（100U/ml）、胎牛血清（10%）和链霉素（100U/ml）的DEMN培养基培养和传代。当细胞状态达到良好后，将所有细胞用无血清的DEMN培养基培养24h，然后随机分为三组，第一组即正常对照组，用含10%正常大鼠血清的DEMN培养基培养；第二组即肝复康治疗组（中药治疗组），用含10%肝复康治疗中剂量组大鼠血清和乙醛200umol/L的DEMN培养基培养；第三组即乙醛组，用含10%正常大鼠血清和乙醛200umol/L的DEMN培养基培养。将以上三组细胞同时放在孵箱中培养，培养条件为37°C、5%CO2混合气体，培养时间为48h。本实验用HE染色法观察肝组织的形态结构变化；用免疫组化法观察各组肝脏组织中α-SMA的表达；用逆转录-聚合酶链反应法（reverse transcriptase polymerasechain reaction，RT-PCR）测定肝组织和肝星状细胞caspase-3, caspase-9，Cyt-C，α-SMA, typeⅠcollagen and type Ⅲcollagen的基因表达水平。实验结果：（1）实验动物大体观察：正常对照组大鼠生长状态良好，善动，体重不同程度的增加；模型组大鼠在造模后精神萎靡、常常蜷缩、皮毛晦暗、易激惹、进食水减少，体重增长缓慢甚至不同程度下降；中药治疗组大鼠精神、活动量、生长发育等方面虽较正常组差，但均好于模型组。将大鼠处死后可见：正常对照组大鼠肝脏质地柔软、表面红润；模型组大鼠肝脏表面粗糙、多处结节、颜色晦暗、肝脏本身发硬、部分腹腔内有腹水；肝复康治疗组大鼠肝脏与模型组相比，质地较为柔软、表面较为光滑。（2）肝脏组织HE染色的光镜观察：正常对照组大鼠肝脏肝小叶结构完整，纹理清晰，肝索呈放射状排列并无炎症细胞浸润；模型组大鼠肝脏可见肝小叶结构紊乱，肝细胞肿大，脂肪变性明显，大量纤维组织增生，纤维间隔内有大量单核、淋巴、嗜酸粒及成纤维等细胞存在，部分纤维组织包绕分割肝细胞形成假小叶；肝复康治疗组大鼠肝脏与模型组相比，肝小叶结构改善，肝组织脂肪变性减轻，纤维间隔变细，其中以中剂量治疗组大鼠改善明显，低剂量治疗组和高剂量组肝组织结构也有所改善。各组评分均比模型组明显降低，三个治疗组以中剂量组降低最为明显。（3）免疫组织化学检测α肌动蛋白（α-SMA）在肝组织中表达：正常对照组α-SMA只表达于小动脉及小静脉，于胆管中没有表达；模型组α-SMA呈长梭形或椭圆形，主要表达于汇管区及纤维间隔。实验结果发现：α-SMA免疫组织化学染色面积在模型组中表达明显升高，在中药治疗组中表达显著下调（较模型组），其中以中剂量治疗组下调更加明显。（4）RT-PCR检测大鼠肝组织中凋亡相关蛋白mRNA的表达：与正常对照组相比，模型组Cyt-c的表达显著下调（P<0.01）；而与模型组相比，肝复康治疗组Cyt-c的表达明显上调，以中剂量上调最为明显（P<0.01）。与正常对照组相比，模型组中凋亡蛋白caspase-3, caspase-9的表达显著下调（P<0.01）；而与模型组相比，肝复康治疗组中caspase-3, caspase-9的表达显著上调，以中剂量最为显著（P<0.01）。为进一步证实中药肝复康的抗肝纤维化作用，本实验同时检测了α-肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（ColleganⅠ）、Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）的mRNA表达。与正常对照组比较，模型组中α-SMA、ColleganⅠ、Collagen Ⅲ表达显著上调（P<0.01）；而与模型组相比，肝复康治疗组各指标表达均明显下调，以中剂量最为显著（P<0.01）。（5）肝复康对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞株中凋亡相关蛋白的影响为找到更加理想的刺激HSC-T6细胞的方法，在预实验中分别用CCl4和乙醛对HSC细胞进行刺激。结果发现乙醛(200umol/L)组肝星状细胞（HSC）中的α-肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（ColleganⅠ）和Ⅲ型胶原（Collagen Ⅲ）等指标的表达均明显增加（P<0.01）；乙醛刺激组中cyt-c，caspase-3, caspase-9的表达与正常组相比明显下调。而肝复康治疗组与正常组接近，α-SMA、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原等指标的表达与乙醛组相比明显减少（P<0.01）；肝复康治疗组中cyt-c，caspase-3, caspase-9的表达与乙醛组相比明显上调。上述细胞实验的结果基本与大鼠肝组织结果相一致。（6）Cyt-c和caspase-3, caspase-9, Collagen I，Collagen Ⅲ and α-SMA之间的相关性分析相关性分析结果显示cyt-c和caspase-3、 caspase-9的表达呈正相关，与CollagenI、Collagen Ⅲ、α-SMA表达呈负相关。结论：1.肝纤维化大鼠肝组织和肝星状细胞中caspase-3、caspase-9等凋亡相关蛋白表达的变化可能在肝纤维化发生发展的过程中发挥重要作用。2.诱导肝星状细胞凋亡相关蛋白的表达可能是肝复康治疗肝纤维化的机制之一，其作用以中剂量治疗效果最佳。

全文目录

摘要  7-10
Abstract  10-14
前言  14-15
材料和方法  15-20
  1. 材料  15-17
    1.1 中药  15
    1.2 动物  15
    1.3 细胞  15
    1.4 主要试剂  15-16
    1.5 其他试剂  16
    1.6 主要仪器  16
    1.7 主要应用软件  16-17
  2. 实验方法  17-20
    2.1 整体实验  17-19
    2.2 离体实验  19-20
  3. 统计学分析  20
结果  20-27
  1. 整体实验  20-25
    1.1 实验动物大体观察  20
    1.2 肝脏组织 HE 染色的光镜观察  20-22
    1.3 免疫组织化学检测α肌动蛋白（α-SMA）在肝组织中表达  22-23
    1.4 RT-PCR 检测大鼠肝组织中凋亡相关蛋白 mRNA 的表达  23-24
    1.5 cyt-c和caspase-3, caspase-9, Collagen I，Collagen Ⅲ and α-SMA之间的相关性分析  24-25
  2. 离体实验  25-27
    2.1 肝复康对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞株中凋亡相关蛋白的影响  25-26
    2.2 cyt-c和caspase-3, caspase-9, Collagen I，Collagen Ⅲ andα-SMA之间的相关性分析  26-27
讨论  27-29
结论  29-30
参考文献  30-32
综述  32-45
  参考文献  41-45
附录  45-47
致谢  47-48

肝复康对肝纤维化大鼠肝组织及肝星状细胞凋亡相关蛋白的影响

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