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FoxM1核酸探针的构建及应用

作　者: 谢洪朋
导　师: 孟祥贤
学　校: 湖南大学
专　业: 生物医学工程
关键词: 核酸探针 FoxM1 蛋白制备应用检测
分类号:
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

核酸探针，是指能够与特定的靶分子发生特异性的相互作用，并被特定方法探知的分子，是一种可以从分子水平上进行设计、合成以及应用的新兴研究手段，为推动分子生物学和分子医学的发展起了重要的作用。本论文以ForkheadBox（Fox）转录因子家族中的FoxM1为靶标，建立了一套筛选能够特异性、高亲和力靶定转录因子FoxM1的核酸适配体（aptamer）的SELEX（指数富集配体进化技术）体系，并对筛选得到的核酸适配体与靶物质的特异性与亲和力进行了验证。在此基础上，构建了一种利用分子信标（MB）简单、快速、超微量检测脱氧核酶酶切产物的方法。主要工作如下：1．建立了一套筛选特定蛋白的SELEX技术方法。运用已构建正确的PGEX-4T-1-GST-FoxM1-220-335以及PGEX-4T1-GST质粒，在大肠杆菌中表达并纯化了GST-FoxM1-220-335融合蛋白及其GST蛋白，经过八轮体外筛选得到了四条核酸适配体。2．对筛选得到的核酸适配体对靶物质的其特异性与亲和力进行了验证。经荧光检测、核酸凝胶阻滞实验（EMSA）和免疫共沉淀实验（co-ip）等证实筛选得到的核酸适配体能够特异性、高亲和力的靶定转录因子FoxM1。3．基于微球富集技术，利用筛选得到的核酸适配体在体外检测GST-FoxM1-220-335。4．在附录B中，我们建立了一种利用分子信标简单、快速、超微量检测脱氧核酶酶切产物的方法。分子信标（MB）被用来检测模拟的HCV-RNA酶切产物，检测下限为0.02nmol/L。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-7
英文缩写  7-8
目录  8-10
第1章绪论  10-16
  1.1 前言  10
  1.2 SELEX 技术简介  10-11
  1.3 核酸适配体（aptamer）简介  11-12
  1.4 转录因子 FoxM1 简介  12-13
  1.5 分子信标简介  13-14
  1.6 本文构思  14-16
    1.6.1 研究目的  14
    1.6.2 研究方法及技术  14-16
第2章 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的纯化  16-22
  2.1 前言  16-17
  2.2 实验材料  17-18
  2.3 实验方法  18-19
    2.3.1 重组质粒的转化与小量提取  18-19
    2.3.2 重组质粒的酶切与鉴定  19
    2.3.3 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的纯化  19
  2.4 实验结果  19-21
    2.4.1 质粒的转化和鉴定  19-20
    2.4.2 GST-FoxM1-220-335 融合蛋白的纯化  20-21
  2.5 讨论  21-22
第3章转录因子 FoxM1 核酸探针的构建  22-38
  3.1 前言  22-23
  3.2 实验材料  23-24
  3.3 实验方法  24-31
    3.3.1 SELEX 文库的构建及其引物的设计  24-25
    3.3.2 转录因子 FoxM1 核酸适配体的筛选  25-27
    3.3.3 克隆测序及二级结构分析  27
    3.3.4 核酸适配体与 FoxM1 结合能力分析  27-31
  3.4 实验结果  31-36
    3.4.1 转录因子 FoxM1 核酸适配体的筛选  31-33
    3.4.2 核酸适配体与 FoxM1 结合能力分析  33-36
  3.5 讨论  36-38
第4章基于微球富集的核酸适配子体外检测转录因子转录因子 FoxM1  38-43
  4.1 前言  38-39
  4.2 实验材料  39
  4.3 实验方法  39-41
    4.3.1 核酸探针的设计  39-40
    4.3.2 实验条件优化  40
    4.3.3 基于微球富集技术利用核酸适配子体外检测转录因子转录因子 FoxM1  40-41
  4.4 实验结果  41-42
    4.4.1 实验条件优化  41-42
    4.4.2 基于微球富集核酸适配子体外检测靶蛋白 GST-FoxM1-220-335  42
  4.5 讨论  42-43
结论  43-45
参考文献  45-49
附录A 攻读硕士学位期间发表的论文目录  49-50
附录B 分子信标用于脱氧核酶切割产物的快速检测  50-55
  B.1 前言  50
  B.2 实验材料  50-51
  B.3 实验方法  51-52
    B.3.1 人工合成的脱氧核酶酶切产物的检测  51-52
    B.3.2 脱氧核酶模拟的 HCV-RNA 酶切产物的检测  52
  B.4 实验结果  52-54
    B.4.1 人工合成的脱氧核酶酶切产物的检测  52-53
    B.4.2 脱氧核酶模拟的 HCV-RNA 酶切产物的检测  53-54
  B.5 讨论  54-55
附录C 常用缓冲液和试剂配方  55-58
致谢  58

FoxM1核酸探针的构建及应用

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