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通络救脑注射液两有效组分栀子苷、三七总皂苷发挥血管保护作用的配伍机制研究

作　者: 郭晓谨
导　师: 李兴广
学　校: 北京中医药大学
专　业: 临床中药学
关键词: 脑微血管内皮细胞通络救脑注射液栀子苷三七总皂苷氧化应激血管再生因子
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

缺血性中风属于中医“络病”的范畴,其病机关键是“毒损脑络”。中药复方“通络救脑注射液”是在“毒损脑络”病机假说基础上研发的纯中药注射液,以解毒通络的治法为依据,选用通泻三焦火毒的栀子为君药,和营止血、通脉行瘀的三七为臣药,两者配伍解营卫之毒,和血通络,在缺血性脑损伤中发挥了良好的脑保护作用。前期的研究结果显示：该注射液具有减轻缺血后脑水肿,减少脑梗塞面积、改善神经细胞损害等作用。临床试验也显示该注射液能明显改善中风患者的临床症状,减少神经功能缺损积分。本文从通络救脑注射液有效组分栀子苷、三七总皂苷在抗氧化损伤、血管营养因子表达两个方面的作用机制及配伍特征进行深入研究,以丰富其“解毒通络”的生物学内涵,初步讨论中药复方的配伍特征,为研究现代化中药制剂提供实验依据。目的：本实验以脑微血管内皮细胞为切入点,通过氧糖剥夺制备拟缺血损伤模型,从抗氧化损伤、血管营养因子表达两个方面观察通络救脑注射液及其两有效组分栀子苷和三七总皂苷发挥血管保护作用方面各自的药效特征,以期从分子层面对该注射液的组分配伍规律和药效机制进行科学诠释,为该中药复方组分配伍的科学内涵提供实验依据。方法：1.采用原代取材方法获得大鼠脑微血管内皮细胞(Microvascular endothelial cell, MVEC),进行培养、纯化和传代。采用氧糖剥夺的方法建立细胞拟缺血损伤模型。2.筛选通络救脑注射液及其两组分——栀子苷、三七总皂苷的用药浓度：观察三种药物各浓度梯度对拟缺血损伤MVEC活性的影响,采用CCK-8方法检测细胞活性,从而确定三种药物发挥药效的最佳浓度。3.观察通络救脑注射液及其两组分——栀子苷、三七总皂苷对拟缺血损伤MVEC活性的影响：将MVEC分为正常组、模型组、栀子苷组、三七总皂苷组以及通络救脑注射液组,给予相应处理后,采用CCK-8方法检测细胞活性。4.观察通络救脑注射液及其两组分——栀子苷、三七总皂苷对拟缺血损伤MVEC氧化应激反应的影响：采用生化法检测三种药物对拟缺血损伤MVEC的丙二醛(malonicdialdehyde,MDA)含量、超氧化物歧化酶(superoxidase dismutase,SOD)活性的变化。5.观察通络救脑注射液及其两组分——栀子苷、三七总皂苷对拟缺血损伤MVEC血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、脑源性神经营养因子(brain derived nerve factor, BDNF)表达的影响：采用免疫蛋白印记法和细胞免疫荧光法检测VEGF、BDNF在各组MVEC的表达情况。结果：1.确定了三种药物的最佳用药浓度：通络救脑注射液411/ml,栀子苷33.2μg/ml,三七总皂苷22μg/ml为最佳药物浓度。2.三种药物对拟缺血损伤MVEC活性的影响：三种药物均能提高拟缺血损伤内皮细胞活性,且均具有统计学差异。与三七总皂苷组比较,通络救脑注射液组细胞活性升高更加明显,且具有统计学差异(P<0.05)。3.三种药物对拟缺血损伤MVEC氧化应激反应的影响：栀子苷可有效降低受损细胞MDA含量,在该方面三七总皂苷作用效果不明显；然而三七总皂苷可显著提高拟缺血损伤后SOD活性,在该方面栀子苷作用效果不明显；通络救脑注射液在这两方面效果均显著。4.三种药物对拟缺血损伤MVEC血管营养因子VEGF、DNF表达的影响：免疫蛋白印记法结果显示：三个给药组较模型组比较VEGF的表达均有显著提高,三七总皂苷与通络救脑注射液组较模型组BDNF的表达明显升高,栀子苷组BDNF的表达升高不明显。细胞免疫荧光法结果显示与免疫蛋白印记法基本一致。结论：1.通络救脑注射液及其有效组分栀子苷、三七总皂苷均可通过抗氧化损伤作用有效减轻MVEC拟缺血损伤,提高细胞活性。栀子苷的抗氧化作用可能与抑制自由基产生和脂质过氧化反应有关,三七总皂苷可能与增强自由基的清除有关,两组分在抗氧化损伤方面,各有侧重,相辅相成,协同配伍,起到“协同、增效”的效果。2.通络救脑注射液及其有效组分栀子苷、三七总皂苷可能通过上调血管再生因子VEGF、BDNF的表达,促进脑缺血损伤后微血管的新生,从而恢复缺血区的血液供应,改善微血管再生环境方面保护缺血脑组织。三七总皂苷比栀子苷的作用更为明显,两组分配伍共同改善缺血区的氧血供应,保护缺血脑组织。总之,栀子苷发挥血管保护作用可能通过其抑制自由基产生和脂质过氧化反应,这可能与栀子“凉血解毒”的功效有关,三七总皂苷发挥血管保护作用可能通过增强自身自由基的清除与上调血管营养因子VEGF、BDNF的表达,这可能与三七“补虚、通络”的功效有关,二者协同配伍,共奏“解毒通络”之效,显示了中药组方配伍发挥整合调节的治疗优势。

全文目录

目录  3-5
中文摘要  5-7
ABSTRACT  7-11
英文缩略词  11-12
上篇文献综述  12-26
  综述一中医的络病理论与缺血性脑中风的研究进展  12-19
    1. 中医的络病理论  12-15
      1.1 络病理论的渊源及其发展  12-13
      1.2 络病理论的主要内容  13
      1.3 从络病理论认识缺血性脑中风  13-14
      1.4 缺血性脑卒中的络病机制——“毒损脑络”病机假说  14-15
    2. 通络救脑注射液及其有效组分解毒通络的理论依据  15-16
      2.1 栀子及其主要成分对缺血性脑病的保护作用  15
      2.2 三七及其有效组分对缺血性脑病的保护作用  15-16
    3. 小结  16-17
    参考文献  17-19
  综述二血管内皮细胞与缺血性脑病关系的研究进展  19-26
    1. 血管内皮细胞的来源与功能  19-20
      1.1 屏障功能  19-20
      1.2 内分泌功能  20
    2. 脑缺血与内皮细胞的功能障碍  20-21
      2.1 氧化应激在内皮细胞损伤中的作用  20-21
      2.2 炎症反应在内皮细胞损伤中的作用  21
    3. 血管新生与缺血性脑血管病  21-24
      3.1 血管新生的概念  21
      3.2 缺血性脑卒中后血管新生的调控机制  21-24
    参考文献  24-26
下篇实验研究  26-57
  前言  26
  实验一：通络救脑注射液—及其组分栀子苷、三七总皂苷用药浓度的筛选  26-36
    材料与方法  27-31
      1. 实验材料  27-28
      2. 实验方法  28-31
    实验结果  31-34
      1 不同浓度的通络救脑注射液对拟缺血内皮细胞活性的影响  31-32
      2 不同浓度的栀子苷对拟缺血损伤内皮细胞活性的影响  32-33
      3 不同浓度的三七总皂苷对拟缺血损伤内皮细胞活性的影响  33-34
    讨论  34-35
    参考文献  35-36
  实验二：三七、栀子组分配伍对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞氧化应激反应的影响  36-45
    材料与方法  36-40
      1. 实验材料  36
      2. 实验方法  36-40
    实验结果  40-43
      1 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞活性的影响  40-41
      2 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞MDA含量的检测结果  41-42
      3 各组药物对拟缺血损伤内皮细胞SOD活性的检测结果  42-43
    讨论  43-44
    参考文献  44-45
  实验三：三七、栀子组分配伍对拟缺血损伤脑微血管内皮细胞血管再生因子表达的影响  45-57
    材料与方法  45-50
      1. 实验材料  45-46
      2. 实验方法  46-50
    实验结果  50-54
      1 脑微血管内皮细胞VEGF的表达情况  50-52
      2 拟缺血损伤后脑微血管内皮细胞BDNF的表达情况  52-54
    讨论  54-56
    参考文献  56-57
结语  57-58
致谢  58-59
个人简历  59

通络救脑注射液两有效组分栀子苷、三七总皂苷发挥血管保护作用的配伍机制研究

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