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基于细胞自噬探讨温阳化瘀开窍方对脑梗塞缺血再灌注损伤保护作用机制

作　者: 莫雪妮
导　师: 唐农
学　校: 湖南中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 脑缺血再灌注损伤 扶阳 自噬 信号转导通路
分类号: R285.5
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要


目的：温阳化瘀开窍方干预MCAO／R大鼠后,与自噬抑制剂3-MA,自噬诱导剂雷帕霉素、特异性PKA抑制剂比较,观察不同再灌注时间大鼠神经功能缺陷评分、脑梗死体积百分比,缺血区、半影区、非缺血区三部分自噬水平及自噬蛋白Beclin1、bc1-2表达的变化及p-CREB表达变化,探讨温阳化瘀开窍方对大鼠脑缺血再灌注损伤中自噬调节的保护作用影响。方法：SD雄性大鼠采用改良线栓法(MCAO/R)造模,随机分为8组,分为空白组、模型组、温阳化瘀开窍方低剂量组、温阳化瘀开窍方中剂量组、温阳化瘀开窍方高剂量组、自噬抑制剂组、自噬诱导剂组、H-89组。观测神经功能缺陷评分、脑梗死体积比、缺血脑组织病理形态学光镜分析。同时用透射电镜观察自噬；用Westernblotting检测不同再灌注时间点,不同区域的Beclin1、bc1-2蛋白表达和p-CREB蛋白的表达；用免疫组化定性的观察Beclin1、bc1-2蛋白的表达和p-CREB蛋白表达。结果：神经功能缺陷评分,各干预组在缺血60min,再灌注0.5h、3h、6h、12h时间点,神经功能缺陷评分逐渐增高。中药组在再灌注6h时中药组神经功能损害评分降低与模型组相比,差异有显著意义(P<0.05)。病理形态学发现再灌注6h时,脑水肿达高峰。透射电镜下看到自噬体(AV1),自噬溶酶体(AV2)的大量出现,Western blotting检测Beclin1、Bc1-2的表达在缺血区、缺血半暗区、非缺血区再灌注0.5h开始显著上调,在3h继续上调,在6h最高；中药组和3-MA组中Beclin1含量比模型组显著降低；p-CREB蛋白表达中药组的IDV值比空白组及模型组增大(P<0.05)。免疫组化定性发现中药组海马CA1区锥体细胞Beclin1皆呈弱阳性(+)表达,中药组Beclinl表达的平均光密度值均低于模型组。中药组CREB染色较模型组大脑皮质神经元细胞和海马CA1区锥体细胞P-CREB皆呈强阳性(+++)表达,表达强度明显强于空白组和模型组细胞。结论：温阳化瘀开窍方可降低缺血再灌注损伤(MCAO/R)大鼠的神经功能缺陷评分,减少脑梗死体积,同时减轻脑梗塞区域及减轻脑细胞水肿,温阳化瘀开窍方可以通过下调Beclin1、Bc1-2表达而降低自噬,温阳化瘀开窍能广泛作用于脑部,在脑缺血区、缺血半暗区、非缺血区同时降低Beclin1、Bc1-2含量,改善(MCAO/R)大鼠的自噬水平,从而减轻脑缺血再灌注损伤；温阳化瘀开窍方能增加(MOCA/R)大鼠cAMP/PKA通路的p-CREB表达,广泛作用,起到脑保护效应。

全文目录


缩略词表  7-8
摘要  8-9
Abstract  9-11
引言  11-12
第一部分 理论研究  12-27
  1 中医对缺血性中风的认识  12-14
    1.1 历代医家对中风的认识  12-13
    1.2 缺血性中风的中医诊断和中医治疗  13
    1.3 缺血性中风中药药理研究  13-14
  2 现代医学与缺血性脑中风  14-18
    2.1 缺血性中风的发病因素  15
    2.2 缺血性中风的现代机理研究  15-17
    2.3 缺血性中风的现代医学诊断和治疗  17-18
  3 自噬与缺血性脑中风  18-20
    3.1 自噬概述  19-20
    3.2 自噬与脑缺血  20
  4 火神派扶阳与脑缺血性中风  20-26
    4.1 火神派认识治疗缺血性脑中风的基本思路  21-22
    4.2 温阳化瘀开窍方的设计组成与分析  22-26
  5 小结  26-27
第二部分 实验研究  27-61
  实验一 温阳化瘀开窍方对大鼠脑缺血再灌注损伤的研究  27-38
    1 实验材料  27-28
      1.1 实验动物  27
      1.2 主要仪器  27
      1.3 主要试剂  27-28
      1.4 中药制备  28
    2 实验方法  28-30
      2.1 实验动物分组  28
      2.2 建立模型  28-29
      2.3 神经功能缺损评分  29
      2.4 脑梗死体积测定  29
      2.5 病理形态学光镜观察  29-30
      2.6 统计学分析  30
    3 实验结果  30-36
      3.1 神经功能缺损评分  30-31
      3.2 脑梗死体积测定  31-33
      3.3 病理形态学光镜观察  33-36
    4 讨论  36-38
  实验二 温阳化瘀开窍方对(MCAO/R)大鼠自噬特征性指标Beclin1、bcl-2表达的研究  38-53
    1 实验材料  38-39
      1.1 实验动物  38
      1.2 主要药物及试剂  38-39
      1.3 中药制备  39
      1.4 主要仪器设备  39
    2 实验方法  39-42
      2.1 实验动物分组  39-40
      2.2 建立模型  40
      2.3 神经功能缺损评分  40
      2.4 病理形态学观察  40
      2.5 透射电镜观察自噬  40
      2.6 Western blotting检测自噬相关蛋白Beclin1,bcl-2蛋白的表达  40-42
      2.7 免疫组化检测Beclin1的表达  42
      2.8 统计方法  42
    3 实验结果  42-52
      3.1 神经功能缺损评分  42-43
      3.2 病理形态学观察(详见图2.1)  43-45
      3.3 透射电镜观察自噬(详见图2.2)  45-46
      3.4 自噬相关蛋白Beclin1、Bcl-2表达  46-51
      3.5 免疫组化检测Beclin1的表达  51-52
    4 讨论  52-53
  实验三 温阳化瘀开窍方对MCAO/R大鼠cAMP/PKA/CREB通路的影响  53-61
    1 实验材料  53-54
      1.1 实验动物  53
      1.2 主要药物  53-54
      1.3 主要仪器设备  54
    2 实验方法  54-55
      2.1 实验动物分组  54-55
      2.2 建立模型  55
      2.3 神经功能缺损评分  55
      2.4 免疫印迹检测(Westernblot)p-CREB蛋白表达  55
      2.5 免疫组织化学染色检测p-CREB表达  55
      2.6 统计学分析  55
    3 实验结果  55-59
      3.1 神经功能缺陷评分  55
      3.2 cAMP/PKA通路p-CREB蛋白表达  55-57
      3.3 p-CREB的表达情况  57
      3.4 相同部位不同组别之间CREB含量的异同  57-58
      3.5 免疫组织化学法检测CREB表达  58-59
    4 讨论  59-61
第三部分 结语  61-64
  1 研究结语  61-62
    1.1 温阳化瘀开窍方对(MOCA/R)大鼠脑缺血再灌注损伤的影响  61
    1.2 温阳化瘀开窍方对(MCAO/R)大鼠自噬特征性指标Beclin1、bcl-2表达的研究  61-62
    1.3 温阳化瘀开窍方对MCAO/R大鼠cAMP/PKA信号转导通路的影响  62
  2 本研究创新点  62-63
  3 展望  63-64
致谢  64-65
参考文献  65-75
综述一  75-90
  参考文献  85-90
综述二  90-102
  参考文献  97-102
研究生在学期间发表论文情况  102-103
研究生在学期间获奖励情况  103-104
附录  104

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学 > 中药实验药理
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