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海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠的保护作用及其免疫调节机制的研究

作　者: 张云城
导　师: 盛国光
学　校: 湖北中医药大学
专　业: 中医内科学
关键词: 免疫性肝损伤刀豆蛋白A 免疫平衡细胞因子海珠益肝加味方
分类号: R259
类　型: 博士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

目的：在我国慢性乙型病毒性肝炎(Chronic hepatitis B CHB)的防治虽然取得了一定的进步,但现状并不是乐观,约10%～20%慢性乙型病毒性肝炎可发展为肝硬化,1%～5%慢性乙型病毒性肝炎可演变为肝癌,CHB的防治形势依然严峻。因此慢性乙型病毒性肝炎仍然是我国突出的公共卫生问题。在慢性乙型病毒性肝炎治疗方面,干扰素和核苷类似物无疑是首要选择,但是干扰素难以适应的副作用、基本上需要终身服用的核苷类似物限制自身的使用,很显然应用干扰素和核苷类似物抗乙肝病毒不能解决慢乙肝患者的所有问题。中医药的免疫功能调节治疗无疑是积极防治慢性乙型病毒性肝炎的有效方法。近些年来,已经有许多临床治疗慢性乙型病毒性肝炎的中药单体或者复方,但其调节免疫功能机理都不是十分清楚。海珠益肝加味方是导师盛国光教授在中医理论指导下,经过多年临床验证和实验研究,在海珠益肝方的基础不断优化的纯中药复方制剂。海珠益肝加味方由叶下珠、白花蛇舌草、茯苓、海藻、白芥子、莪术、枸杞、太子参八味药组成的经验方。具有解毒、化痰、消瘀、补虚的功效。早期研究提示海珠益肝加味方可能通过某些途径、环节和靶点达到双向调节免疫功能的作用,其作用机制很有待于进行深入研究。本课题以免疫肝损伤小鼠动物模型为实验对象,对海珠益肝加味方进行研究,观察中药复方海珠益肝方加味方对实验小鼠的免疫状态、脾细胞细胞因子的mRNA基因表达、辅助性T淋巴细胞Thl/Th2、Toll样受体(TLR)及其信号转导途径的影响,并运用计算机统计学软件进行数据处理和综合分析,探讨海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠的保护作用及其免疫调节机制,进一步提高慢性乙型病毒性肝炎的临床治疗水平。方法：实验分五个部分进行第一部分：海珠益肝方及其扩方对Concanavalin A(刀豆蛋白A)诱导免疫性肝损伤小鼠的保护作用。清洁级昆明小鼠100只,随机分为空白组(1)、模型组(2)、醋酸强的松组(3)、海珠益肝方组(4)、海珠益肝方加太子参枸杞子组(5)、海珠益肝方加太子参仙灵脾组(6)、海珠益肝方加枸杞子仙灵脾组(7)、叶下珠白花蛇舌草组(8)、海藻茯苓白芥子组(9)及莪术组(10),每组10只,采用刀豆蛋白A尾静脉注射法制作免疫性肝损伤动物模型。造模前12天,模型组、空白组给予蒸馏水灌胃,其余组每日分别给予醋酸泼的松、海珠益肝全方、海珠益肝方加太子参枸杞子、海珠益肝方加太子参仙灵脾、海珠益肝方加枸杞子仙灵脾、叶下珠白花蛇舌草、海藻茯苓白芥子及莪术灌胃。末次灌胃给药后1h,空白组给予生理盐水10ml/kg尾静脉注射,其余各组按照20mg/kg尾静脉注射刀豆蛋白A造模,禁食自由饮水。造模给药8h后颈椎脱臼处死动物摘取肝脏和脾脏,生理盐水中清洗后称记重量,计算肝脾指数。肝组织标本匀浆离心后取上清液检测丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)及超氧化物歧化酶(SOD)的值。另外取0.2g肝组织固定、脱水、石蜡包埋、切片后行HE染色,光学显微镜下观察肝脏组织形态学变化。第二部分：海珠益肝方加味方对Con A诱导免疫性肝损伤小鼠血清IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-α的影响。清洁级昆明小鼠40只,随机分为空白组(1)、模型组(2)、醋酸强的松组(3)、海珠益肝加味方组(4),每组10只,采用刀豆蛋白A尾静脉注射法制作免疫性肝损伤模型。造模前12天,模型组、空白组给予蒸馏水灌胃,其余组每日分别给予醋酸强的松、海珠益肝加味方灌胃。末次灌胃给药后1h,空白组给予生理盐水10ml/kg尾静脉注射,其余各组按照20mg/kg尾静脉注射刀豆蛋白A造模,禁食自由饮水。造模给药8h后摘眼球取血,离心后留取血清。采用ELISA方法测定小鼠血清IL-4、IL-6、IFN-γ、TNF-α的值。第三部分：海珠益肝方加味方对Con A诱导免疫性肝损伤小鼠肝组织病理变化及肝组织NF-KP65的表达水平的影响。清洁级昆明小鼠40只,随机分为正常组(1)、模型组(2)、醋酸强的松组(3)、海珠益肝加味方组(4),每组10只,采用Con A尾静脉注射法制作免疫性肝损伤模型。造模给药8h后处死小鼠,取肝组织制作肝脏的超微病理切片,采用电镜透射法观察各组肝细胞内超微结构的病理变化,同时取肝组织用Western-blot法测定小鼠肝组织NF-KP65的表达水平。第四部分：海珠益肝方加味方对Con A(刀豆蛋白A)诱导免疫性肝损伤小鼠脾组织IL-6、TNF-αmRNA影响。清洁级昆明小鼠40只,随机分为空白组(1)、模型组(2)、醋酸强的松组(3)、海珠益肝加味方组(4),每组10只,采用刀豆蛋白A尾静脉注射法制作免疫性肝损伤小鼠模型。采用RT-PCR法测定小鼠脾组织IL-6、TNF-α mRNA的表达。第五部分：海珠益肝方加味方对Concanavalin A诱导免疫性肝损伤小鼠肝组织TLR4、CD14mRNA影响。清洁级昆明小鼠40只,随机分为空白组(1)、模型组(2)、醋酸强的松组(3)、海珠益肝加味方组(4),每组10只,采用刀豆蛋白A尾静脉注射法制作免疫性肝损伤模型。采用RT-PCR法测定小鼠肝组织TLR4、CD14mRNA的表达。结果：第一部分：海珠益肝方及其扩方对Con A(刀豆蛋白A)诱导免疫性肝损伤小鼠的保护作用。1成功建立小鼠免疫性肝损伤模型。与正常组比较,模型组小鼠肝脾指数、肝组织匀浆后上清液ALT、AST水平及MDA含量均明显升高(P<0.05),肝组织匀浆后上清液SOD水平明显降低。模型组肝组织内大量淋巴细胞浸润,部分汇管区淋巴细胞浸润,肝板消失、凋亡小体散在、肝细胞成脂肪样变性。血管周围的肝细胞胞浆疏松,染色明显变浅,肝窦间隙明显增宽,肝索消失,可见点状坏死、淋巴细胞浸润。2与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味各组可降低小鼠肝脾指数,降低肝组织ALT、AST水平及MDA含量,提高肝组织的SOD水平(P<0.05),其中以海珠益肝加太子参、枸杞子组更明显。另外与模型组比较,海珠益肝方加味组肝脏病理变化有不同程度减轻。第二部分：海珠益肝方加味方对刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤小鼠血清IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-α的影响。1与正常组比较,模型组小鼠血清中IFN-γ、TNF-α的水平明显升高,差异有显著性(P<0.05)。模型组小鼠血清IL-4、IL-6的水平明显降低,统计学上差异有显著性(P<0.05)。2与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味组血清中IFN-γ、TNF-α的水平明显降低,差异有显著性(P<0.05)。对照组和海珠益肝方加味方组小鼠血清中IL-6的水平明显升高,差异有显著性(P<0.05)。对照组和海珠益肝方加味方组小鼠血清中IL-4的水平明显升高,统计学差异有显著性(P<0.05)。第三部分：海珠益肝方加味方对Con A诱导免疫性肝损伤小鼠肝组织病理变化及肝组织NF-KP65的表达水平的影响。1正常组肝细胞核呈圆形及卵圆形,核膜光滑平整,染色质均匀分布在核内。模型组肝细胞肿胀,胞质疏松,出现深浅不一的切迹,胞质中常见髓样体及空泡变性区,线粒体肿胀,嵴模糊,内质网轻度扩张。与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味组肝细胞肿胀明显减轻,未见明显毛细胆管扩张,线粒体轻度肿胀,嵴存在,内质网无明显扩张。2与正常组比较,模型组NF-KP65的水平明显升高,统计学有显著差异(P<0.05)；与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味组NF-KP65的水平有明显变化,统计学有显著差异(P<0.05)。第四部分：海珠益肝方加味方对刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤小鼠小鼠脾组织IL-6、TNF-α mRNA影响。1与正常组比较,模型组IL-6mRNA的水平有明显降低,统计学有显著差异(P<0.05)；与正常组比较,模型组TNF-αmRNA的水平显著升高,统计学有显著差异(P<0.05)。2与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味组IL-6mRNA的水平明显升高,统计学有显著差异(P<0.05)。与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味组TNF-α mRNA的水平明显下降,统计学有显著差异(P<0.05)。第五部分：海珠益肝方加味方对刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤小鼠肝组织TLR4、CD14mRNA影响。1与正常组比较,模型组TLR4mRNA的表达水平明显降低,具有显著性差异(P<0.05)；与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味组TLR4mRNA的表达水平明显升高,具有显著性差异(P<0.05)。2与正常组比较,模型组CD14mRNA的水平无明显变化,经统计学处理无显著性差异(P>0.05)；与模型组比较,对照组和海珠益肝方加味组CD14mRNA的水平无明显变化,未见明显差异(P>0.05)。结论：1、海珠益肝方加味对免疫性肝损伤小鼠的肝脏功能有较好的保护作用。2、海珠益肝方加味对免疫性肝损伤小鼠的肝脏功能有较好的保护作用的机制可能是维持Th1/Th2之间的平衡；抑制过抗的脾脏的细胞免疫功能,增强调节天然免疫功能,从而达到免疫功能的双向调节。

全文目录

中文摘要  5-10
Abstract  10-18
中英文缩略词表  18-20
前言  20-24
第一部分海珠益肝及其加味方对刀豆蛋白A诱导小鼠免疫性肝损伤的保护作用  24-31
  摘要  24-25
  1 材料  25
  2 方法  25-26
  3 结果  26-29
  4 讨论  29-31
第二部分海珠益肝加味方对刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤小鼠血清IL-4、IL-6、INF-γ、TNF-α的影响  31-36
  摘要  31
  1 材料  31-32
  2 方法  32
  3 结果  32-33
  4 讨论  33-36
第三部分海珠益肝方加味方对Con A诱导免疫性肝损伤小鼠肝组织病理变化及肝组织NF-KP65的表达水平的影响  36-44
  摘要  36
  1 材料  36-38
  2 方法  38-40
  3 结果  40-41
  4 讨论  41-44
第四部分海珠益肝加味方对刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤小鼠脾组织IL-6、TNF-α mRNA的影响  44-50
  摘要  44
  1 材料  44-45
  2 方法  45-47
  3 结果  47-48
  4 讨论  48-50
第五部分海珠益肝加味方对刀豆蛋白A诱导免疫性肝损伤小鼠肝组织TLR4、CD14 mRNA的影响  50-56
  摘要  50
  1 材料  50-51
  2 方法  51-53
  3 结果  53-54
  4 讨论  54-56
讨论  56-67
  1 CHB发生免疫性肝损伤的机制及治疗方案  56-59
  2 中医对慢性乙型肝炎的认识  59-62
  3 免疫性肝损伤模型的研究  62-63
  4 海珠益肝加味方的来源、组成、功效  63
  5 本课题的主要研究结果  63-65
    5.1 免疫性肝损伤动物模型的建立  63-64
    5.2 海珠益肝加味方抗免疫性肝损伤的可能免疫机理  64-65
  6 本课题创新点  65
  7 本课题存在主要问题的思考  65-67
    7.1 模型的制作  65-67
结语  67-68
参考文献  68-76
附录  76-96
  1 文献综述  76-91
    参考文献  85-91
  2 附图  91-95
  3 学习期间发表的论文  95-96
致谢  96

海珠益肝加味方对免疫性肝损伤小鼠的保护作用及其免疫调节机制的研究

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