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褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养与褐藻水解产物的应用研究

作　者: 李安雪
导　师: 汪立平
学　校: 上海海洋大学
专　业: 食品科学与工程
关键词: 褐藻胶裂解酶高密度发酵褐藻寡糖重组大肠杆菌分批补料发酵
分类号: S968.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

褐藻中含有丰富的褐藻多糖和甘露醇，褐藻经过处理之后得到褐藻寡糖和甘露醇。褐藻寡糖和甘露醇在理论上可以被微生物利用生产乙醇。另外，褐藻寡糖还有很多独特的生理活性，在食品、医疗、农业等行业都具有巨大的应用前景。酶解法由于其反应条件温和、易控制、产物均一的优点被广泛应用在多糖的水解方面。目前发现的褐藻胶裂解酶产生菌酶产量低，酶活力小；虽然，随着基因工程的发展，超过20种褐藻胶裂解酶的基因得到克隆和测序，并构建出多种重组褐藻胶裂解酶基因工程菌，但目前所构建的重组褐藻胶裂解酶基因工程表达水平还比较低，远远不能满足工业化制备褐藻寡糖的需求。获得高活性的褐藻胶裂解酶成为制备褐藻胶寡糖的关键步骤。若能提高褐藻胶裂解酶的产量及酶活力，制备出大量褐藻胶寡糖则在多方面都具有重要的意义。为了提高重组基因工程菌褐藻胶裂解酶的产量，有必要对基因工程菌进行高密度发酵研究，通过发酵工程技术生产更多的褐藻胶裂解酶。本研究以实验室构建的褐藻胶裂解酶基因工程菌作为菌种，通过改变高密度发酵过程中的补料策略，提高藻胶裂解酶基因工程菌的菌体密度，从而提供褐藻胶裂解酶的表达量，提高褐藻胶裂解酶的活性。并利用发酵后制备的褐藻胶裂解酶制备褐藻寡糖，研究褐藻寡糖的作用；为提高褐藻的有效利用开辟了新的途径。1.本文在5L发酵罐中，利用分批补料培养技术高密度培养含表达褐藻胶裂解酶重组质粒的工程菌E.coli BL21，生产褐藻胶裂解酶。利用单因素实验对补料培养基中碳源浓度进行优化，利用单因素实验和单纯形优化法对诱导时间和IPTG浓度进行了优化。得到最适高密度发酵条件为：发酵培养基为葡萄糖10g/L，酵母提取物5g/L，蛋白胨20g/L；补料培养基为葡萄糖150g/L，蛋白胨20g/L，酵母提取物10g/L，4-10h的流加速率为100mL/h，10-16h的流加速率设定为200mL/h；诱导时间为4.5h，IPTG终浓度为0.60mmol/L，发酵过程中溶解氧控制在30%-40%，pH控制在7.0-7.2。IPTG未诱导时，最终发酵液中菌液稀释200倍后，OD600达0.696，菌体浓度达65.38g/L；IPTG诱导后菌液稀释200倍后，OD600达0.457，菌体浓度达60.15g/L，是分批发酵的8.43倍；菌体进行超声波破碎后制备粗酶液，酶活力达26.37U/mL，是分批发酵的5.48倍。2.通过对影响褐藻胶裂解酶水解褐藻胶效率的5个因素：底物浓度、加酶量、反应时间、反应温度和pH值进行单因素及正交实验，确定了最佳水解条件：pH值6.0水，解温度50℃，水解时间4h，加酶量45%，底物浓度0.4%。在最优水解条件下，利用褐藻胶裂解酶水解褐藻胶制备褐藻寡糖，褐藻寡糖的产量为0.541g/g海藻酸钠。对褐藻寡糖对双歧杆菌的增殖作用进行研究，结果表明增殖效果显著，以褐藻寡糖为碳源的改良MRS培养基平衡期双歧杆菌体浓度达到3.09×10~8cfu/mL，比以葡萄糖为碳源的MRS培养基所得菌体浓度提高3.68倍。3.利用热带假丝酵母发酵甘露醇产乙醇，通过对影响发酵的5个因素：发酵温度、发酵时间、装液量、接种量、初始pH进行单因素并选取相关因子进行正交实验，确定了产乙醇的最佳条件为：甘露醇发酵浓度为60g/L，接种量8%，初始pH5.0，发酵温度36℃，发酵液体积120ml。在最佳发酵条件下发酵72h，乙醇生成量为2.423%。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-13
第一章引言  13-27
  1.1 褐藻的主要成分  13
  1.2 褐藻胶  13-14
    1.2.1 组成结构  13
    1.2.2 褐藻胶的来源  13-14
    1.2.3 褐藻胶的应用  14
  1.3 甘露醇  14-15
    1.3.1 甘露醇的性质  14
    1.3.2 甘露醇的来源  14-15
    1.3.3 甘露醇的应用  15
  1.4 褐藻胶裂解酶  15-19
    1.4.1 褐藻胶裂解酶的来源和分类  15-16
    1.4.2 褐藻胶裂解酶的结构  16
    1.4.3 褐藻胶裂解酶的作用机理  16-17
    1.4.4 褐藻胶裂解酶的活性检测方法  17
    1.4.5 褐藻胶裂解酶的基因工程研究  17-19
  1.5 褐藻寡糖  19-20
    1.5.1 褐藻寡糖的制备  19-20
    1.5.2 褐藻寡糖的应用  20
  1.6 重组大肠杆菌高密度发酵研究  20-25
    1.6.1 影响高密度发酵的因素  21-24
      1.6.1.1 重组大肠杆菌构建的影响因素  21
      1.6.1.2 培养条件的影响  21-23
      1.6.1.3 生长抑制因子的影响  23
      1.6.1.4 补料控制的影响  23-24
    1.6.2 重组大肠杆菌高密度发酵的研究进展  24-25
  1.7 本研究的目的、意义和内容  25-27
    1.7.1 研究目的和意义  25-26
    1.7.2 研究内容  26-27
第二章重组褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养  27-44
  2.1 引言  27
  2.2 材料与设备  27-29
    2.2.1 菌种  27
    2.2.2 主要试剂  27-28
    2.2.3 主要仪器设备  28
    2.2.4 培养基  28-29
  2.3 实验方法  29-33
    2.3.1 培养方法  29-30
      2.3.1.1 菌种活化  29
      2.3.1.2 摇瓶培养  29
      2.3.1.3 发酵罐的分批培养  29
      2.3.1.4 发酵罐的分批补料培养  29-30
    2.3.2 菌体的收集及粗酶液的制备  30
    2.3.3 发酵罐采样及分析方法  30-32
      2.3.3.1 发酵罐采样  30
      2.3.3.2 菌体密度  30
      2.3.3.3 细胞浓度  30
      2.3.3.4 残糖浓度  30-31
      2.3.3.5 酶活测定  31
      2.3.3.6 总蛋白含量  31-32
      2.3.3.7 平均比生长速率[82]  32
    2.3.4 不同葡萄糖浓度对工程菌发酵的影响  32
    2.3.5 不同蛋白胨浓度对工程菌发酵的影响  32
    2.3.6 补料培养基中葡萄糖浓度对工程菌补料分批发酵的影响  32
    2.3.7 IPTG 诱导条件对工程菌补料分批发酵的影响  32-33
      2.3.7.1 IPTG 诱导时间  32-33
      2.3.7.2 IPTG 浓度  33
      2.3.7.3 单纯形优化法  33
    2.3.8 褐藻胶裂解酶底物专一性的研究  33
  2.4 结果与分析  33-43
    2.4.1 葡萄糖标准曲线绘制  33-34
    2.4.2 蛋白质标准曲线的绘制  34-35
    2.4.3 不同葡萄糖浓度对工程菌发酵的影响（摇瓶发酵）  35-36
    2.4.4 不同蛋白胨浓度对工程菌发酵的影响（摇瓶发酵）  36-38
    2.4.5 褐藻胶裂解酶基因工程菌的分批发酵（发酵罐培养）  38-39
    2.4.6 补料培养基中葡萄糖浓度对工程菌补料分批发酵的影响  39-40
    2.4.7 IPTG 诱导条件对工程菌补料分批发酵的影响  40-42
      2.4.7.1 IPTG 诱导时间  40-41
      2.4.7.2 IPTG 浓度  41
      2.4.7.3 单纯形优化法  41-42
    2.4.8 底物专一性的研究  42-43
  2.5 小结  43-44
第三章褐藻胶裂解酶水解褐藻胶条件的优化及褐藻寡糖的利用研究  44-57
  3.1 引言  44
  3.2 材料与设备  44-46
    3.2.1 菌种  44-45
    3.2.2 主要试剂  45
    3.2.3 主要仪器设备  45
    3.2.4 培养基  45-46
  3.3 实验方法  46-49
    3.3.1 培养方法  46
    3.3.2 菌体收集及粗酶液制备及纯化  46-47
    3.3.3 酶活测定  47
    3.3.4 褐藻胶水解液中褐藻寡糖的测定  47
    3.3.5 不同因素对褐藻胶裂解酶水解效果的研究  47-48
      3.3.5.1 温度对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  47
      3.3.5.2 pH 对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  47
      3.3.5.3 水解时间对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  47-48
      3.3.5.4 加酶量对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  48
      3.3.5.5 底物浓度对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  48
    3.3.6 正交试验设计  48
    3.3.7 褐藻寡糖的制备  48-49
    3.3.8 褐藻胶水解液对双歧杆菌的增值作用  49
      3.3.8.1 双歧杆菌生长曲线的绘制  49
      3.3.8.2 菌落计数  49
  3.4 结果与分析  49-56
    3.4.1 不同因素对褐藻胶裂解酶水解效果的研究  49-52
      3.4.1.1 温度对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  49-50
      3.4.1.2 pH 对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  50-51
      3.4.1.3 时间对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  51
      3.4.1.4 加酶量对褐藻胶裂解酶水解效果的影响  51-52
      3.4.1.5 底物浓度对藻胶酶解效果的影响  52
    3.4.2 正交实验结果  52-54
    3.4.3 褐藻胶水解条件的验证试验  54
    3.4.4 褐藻寡糖的制备  54-55
    3.4.5 褐藻寡糖对双歧杆菌的增值作用  55-56
      3.4.5.1 双歧杆菌生长曲线的绘制  55
      3.4.5.2 不同寡糖培养基中双歧杆菌计数  55-56
  3.5 结论  56-57
第四章热带假丝酵母菌发酵甘露醇产乙醇的条件研究  57-69
  4.1 前言  57-58
  4.2 材料与设备  58-59
    4.2.1 菌种  58
    4.2.2 主要试剂  58
    4.2.3 仪器设备  58
    4.2.4 培养基  58-59
  4.3 试验方法  59-61
    4.3.1 培养方法  59
    4.3.2 菌体密度测定  59
    4.3.3 乙醇含量测定  59-60
    4.3.4 不同甘露醇浓度发酵实验  60
    4.3.5 不同因素对产乙醇效果的研究  60-61
      4.3.5.1 温度对产乙醇效果的影响  60
      4.3.5.2 发酵时间对产乙醇效果的影响  60
      4.3.5.3 初始 pH 对产乙醇效果的影响  60-61
      4.3.5.4 接种量对产乙醇效果的影响  61
      4.3.5.5 装液量对产乙醇效果的影响  61
    4.3.6 发酵条件正交试验设计  61
  4.4 结果与分析  61-68
    4.4.1 乙醇标准曲线制  61-62
    4.4.2 不同甘露醇浓度发酵实验  62-63
    4.4.3 温度对产乙醇效果的影响  63
    4.4.4 发酵时间对产乙醇效果的影响  63-64
    4.4.5 初始 pH 对产乙醇效果的影响  64-65
    4.4.6 接种量对产乙醇效果的影响  65-66
    4.4.7 装液量对甘露醇发酵的影响  66
    4.4.8 正交试验  66-68
  4.5 结论  68-69
全文总结  69-70
参考文献  70-75
附录  75-76
致谢  76-77
在校期间发表论文  77

褐藻胶裂解酶基因工程菌的高密度培养与褐藻水解产物的应用研究

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