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抗犬流感病毒单味中草药体外筛选

作　者: 王珍
导　师: 王振勇
学　校: 山东农业大学
专　业: 兽医
关键词: 犬流感病毒中草药 MTT法筛选
分类号: S853.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

犬流感是由犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)引起的传染性疾病，主要症状有体温升高、咳嗽、流鼻液、呼吸困难等。犬流感传播广泛，严重的可引起犬死亡。另外，抗病毒的化学合成药物主要有病毒唑、病毒灵等，种类比较少，治疗效果较差。外源性的细胞因子能抑制病毒复制，提高提高机体细胞免疫功能，但其针对性较差，长期使用会造成自身免疫力的下降。目前，世界上许多国家都已经加大了对中药的研究。中药治疗流感具有一定的效果，毒副作用小，在治疗病毒感染性疾病方面显示出了独特的优势，但针对流感病毒的中药尚缺乏针对性筛选。本研究主要是以野菊花、连翘、板蓝根、黄连、细辛、穿心莲、地丁、苦参、荆芥、鱼腥草、白头翁、黄柏、茵陈、金银花、蒲公英、大青叶、贯众、黄芩、柴胡、藿香等20种单味中药的提取液为试验药物，并以利巴韦林为阳性对照药物，进行体外抗病毒实验。测试上述药物对犬流感病毒的抗病毒效果，以筛选出较为有效的抗犬流感病毒中药，以期用于临床治疗。各种中草药采用传统的的水煮浸法分别提取、浓缩，制成0.5g/ml的药液。测定药物对MDCK细胞的毒性作用，并确定药物的最大安全浓度，以安全浓度进行抗病毒试验。以MTT法（四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）检测细胞活性，从20种中药中筛选出几种效果较好的抗犬流感病毒的中药。采用分组处理法（Ⅰ组：先加药物后加病毒；Ⅱ组：先加病毒后加药物；Ⅲ、Ⅳ组，药物与病毒同时加入），对已筛选出的药物进行抗病毒机制的初步探索（推断中药作用于病毒感染的哪一个环节）。为犬流感的临床治疗提供依据，同时也为人类及其他动物的抗流感药物的筛选提供借鉴。毒性试验结果：穿心莲、野菊花等20种中草药提取物的最大无毒浓度在0.12~32.25mg/ml之间，利巴韦林的最大无毒浓度为5ug/ml。初筛实验结果：穿心莲、苦参、黄连、蒲公英、野菊花具有极显著的抗病毒效果，穿心莲、苦参、黄连、蒲公英抗流感病毒的效果极显著优于利巴韦林（P<0.01），野菊花抗病毒的效果显著优于利巴韦林（P<0.05），表明穿心莲、苦参、黄连、蒲公英、野菊花能明显的抑制犬流感病毒的感染过程，其效果优于利巴韦林。分组实验的结果：Ⅰ组中，苦参能够极显著的抑制病毒的吸附与进入细胞的过程，极显著地优于利巴韦林（P<0.01）。在Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组中，14种药物对病毒的生物合成与释放具有显著的抑制作用，同时具有直接杀灭病毒的作用，但其效果极显著的低于利巴韦林（P<0.01）。说明14种中草药能够抑制犬流感病毒的吸附与进入细胞，抑制犬流感病毒的生物合成与成熟释放，并对犬流感病毒具有直接杀灭作用，其中苦参抑制犬流感病毒吸附与进入细胞的作用极显著的优于利巴韦林。

全文目录

符号及缩略词  4-7
中文摘要  7-9
Abstract  9-11
引言  11-31
  1.1 犬流感病毒  12-17
    1.1.1 CIV 的病原学特性  12-13
    1.1.2 CIV 亚型的分类  13
    1.1.3 CIV 的特性  13-14
    1.1.4 CIV 的流行病学  14
    1.1.5 CIV 的症状  14
    1.1.6 CIV 的诊断  14-16
    1.1.7 CIV 的治疗  16
    1.1.8 CIV 的疫苗免疫  16-17
  1.2 中草药的研究进展  17-31
    1.2.1 中草药抗病毒的作用机理  17-18
    1.2.2 中草药的分类  18-19
    1.2.3 中药方剂  19-20
    1.2.4 20 种中草药概况  20-31
材料与方法  31-41
  2.1 材料  31
  2.2 试剂和仪器  31-32
    2.2.1 主要试剂  31
    2.2.2 主要仪器  31-32
  2.3 试剂的配制  32-34
    2.3.1 1%鸡红细胞悬液的配制  32
    2.3.2 中药提取物的制备  32-33
    2.3.3 DMEM 培养基的制备  33
    2.3.4 PBS 缓冲液的配制  33
    2.3.5 血清的灭活  33
    2.3.6 台盼蓝的配制  33
    2.3.7 2.5%的胰酶的配制  33-34
    2.3.8 5mg/ml 的 MTT 溶液的配制  34
    2.3.9 细胞冻存液的配制  34
  2.4 实验方法  34-41
    2.4.1 100~200倍TCID_(50)犬流感病毒的制备  34-36
    2.4.2 MDCK 细胞培养  36-37
    2.4.3 中药提取液与利巴韦林的毒性实验  37-39
    2.4.4 初筛  39
    2.4.5 分组实验  39-40
    2.4.6 MTT 法  40-41
实验结果与分析  41-46
  3.1 HA 实验结果  41
  3.2 犬流感病毒 TCID_(50)的测定结果  41-42
  3.3 中药提取液与利巴韦林的毒性实验结果  42
  3.4 初筛结果  42-44
  3.5 分组实验结果  44-46
讨论  46-48
结论  48-49
参考文献  49-57
致谢  57

抗犬流感病毒单味中草药体外筛选

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