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一株O型口蹄疫弱毒株的构建与生物学特性测定

作　者: 史兰广
导　师: 赵启祖
学　校: 中国兽医药品监察所
专　业: 预防兽医学
关键词: 口蹄疫灭活疫苗种毒嵌合弱毒生物学特性
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

口蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth Disease Virus, FMDV)引起的烈性传染病,主要感染牛、羊、猪等家畜。在当前FMD流行的国家和地区,灭活疫苗在疫情防控中仍发挥着重要作用。FMD灭活疫苗的生产必须在生物安全三级以上的车间进行,疫苗生产车间必须有高度安全的防泄漏系统,以防止病毒泄漏、扩散引起疫病暴发。尽管如此,因生产用强毒的泄露而导致的FMD暴发时有发生,造成了巨大的经济损失。因此,在没有安全、有效的FMD新型疫苗的情况下,在灭活疫苗生产中减少或停止使用强毒,寻求使用中等毒力或者弱毒力种毒替换强毒进行生产,才能从根本上解决潜在的散毒危机。本研究在实验室已构建的缺失毒力蛋白Lpro、删除结构蛋白VP1、VP2和VP3并插入多克隆位点SspI和SgrAI的载体上,插入O型FMD疫苗种毒猪源泛亚毒株的结构蛋白VP1、VP2和VP3编码序列,构建感染性克隆,并成功拯救出嵌合弱毒v4-LL,进而研究测定了该病毒的生物学特性。结果发现v4-LL能够在贴壁和悬浮细胞中有效增殖；具有与强毒相同的乳鼠致病力；能导致豚鼠发病,但症状轻微；使用107LD50病毒量接种猪后,猪没有出现典型的FMD症状。结果证明v4-LL具有良好的细胞培养增殖能力,对乳鼠的致病力与强毒相当,对豚鼠的致病力低,对猪无明显致病力。这为使用该嵌合弱毒作为FMD安全制苗种毒的可行性提供了基础试验数据,为使用该弱毒载体系统制备FMD安全种毒做了铺垫,探索了解决当前FMD灭活疫苗生产存在散毒风险的新方法。

全文目录

摘要  3-4
ABSTRACT  4-5
缩略语中英文对照表  5-9
第一章概述  9-17
  1.1 口蹄疫概述  9-10
  1.2 FMDV概述  10-12
    1.2.1 FMDV基因组结构  10-11
    1.2.2 L蛋白  11-12
    1.2.3 结构蛋白  12
    1.2.4 非结构蛋白  12
  1.3 FMD疫苗现状与研究进展  12-16
    1.3.1 灭活疫苗  13
    1.3.2 合成肽疫苗  13-14
    1.3.3 基因工程亚单位疫苗  14
    1.3.4 基因工程活载体疫苗  14-15
    1.3.5 核酸疫苗  15
    1.3.6 基因缺失疫苗  15-16
  1.4 本研究的目的和意义  16
  1.5 技术路线  16-17
第二章 FMD嵌合弱毒v4-LL感染性克隆的构建与病毒拯救  17-34
  摘要  17
  2.1 材料  17-20
    2.1.1 主要试剂、耗材  17-18
    2.1.2 溶液的配制  18-20
    2.1.3 主要仪器  20
    2.1.4 毒株来源  20
  2.2 方法  20-28
    2.2.1 O型FMD疫苗种毒猪源泛亚毒株P1区序列的扩增和克隆  20-23
    2.2.2 含O型FMD疫苗种毒猪源泛亚毒株P1区序列的嵌合弱毒感染性克隆的构建  23-25
    2.2.3 病毒拯救  25-28
    2.2.4 含O型FMD疫苗种毒猪源泛亚毒株P1区序列的嵌合病毒感染性克隆的构建与拯救  28
  2.3 结果  28-32
    2.3.1 猪源泛亚种毒P1区PCR扩增结果  28-29
    2.3.2 T-4-P1的鉴定结果  29
    2.3.3 双酶切结果  29-30
    2.3.4 阳性重组质粒酶切鉴定结果  30-31
    2.3.5 病毒拯救、传代后的CPE  31-32
    2.3.6 RT-PCR检测病毒  32
  2.4 讨论  32-33
  2.5 小结  33-34
第三章 FMD嵌合弱毒v4-LL生物学特性的测定  34-51
  摘要  34
  3.1 材料  34-35
  3.2 方法  35-37
    3.2.1 贴壁细胞培养试验  35-36
    3.2.2 悬浮细胞培养试验  36
    3.2.3 乳鼠致病性试验  36
    3.2.4 豚鼠致病性试验  36
    3.2.5 本动物(猪)致病性与攻毒试验  36-37
  3.3 结果  37-47
    3.3.1 贴壁细胞培养试验结果  37-39
    3.3.2 悬浮细胞培养试验结果  39-42
    3.3.3 乳鼠致病性试验结果  42-43
    3.3.4 豚鼠致病性试验结果  43
    3.3.5 本动物(猪)致病性试验结果  43-46
    3.3.6 攻毒试验结果  46-47
  3.4 讨论  47-50
    3.4.1 细胞培养试验  47-48
    3.4.2 动物试验  48-50
  3.5 小结  50-51
第四章结论  51-52
  4.1 实验结论  51
  4.2 下一步工作设想  51-52
参考文献  52-55
附录  55-61
  1. T-4-P1测序结果与4-P1模板序列比对结果  55-58
  2. v4-LL F4、F8、F12代贴壁培养病毒和悬浮病毒VP1序列比对结果  58-59
  3. v4-WL F4代贴壁培养病毒和悬浮病毒VP1序列比对结果  59-61
致谢  61-62
作者简历  62

一株O型口蹄疫弱毒株的构建与生物学特性测定

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