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甜樱桃内参基因的筛选

作　者: 张芳明
导　师: 宋尚伟
学　校: 河南农业大学
专　业: 果树学
关键词: 甜樱桃内参基因 RNA反转录实时定量PCR
分类号: S662.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

甜樱桃是果实成熟期最早的树种之一，树形美观，果实营养丰富，管理用工少，生产成本低，经济效益极高，所以有着广阔的发展前景。近年来，有关甜樱桃的研究越来越多地采用分子生物学研究方法，而在进行基因表达分析研究时，需要内参基因对目标基因的表达量进行校准，以获得更加准确的结果。本研究以已发表的拟南芥的27个内参基因做为候选，利用qRT-PCR方法分别对其在甜樱桃品种艳阳不同生长时期的枝条、叶片和果实中的表达量，以及对内参基因在干旱、盐害、涝害、高温等逆境条件下植株叶片中的表达量进行分析，利用GeNorm，BestKeeper和NormFinder软件分析候选内参基因的表达稳定性，以期为甜樱桃的基因表达调控相关研究提供合适的内参基因。具体研究结果如下：1、从模式植物中共选取了27对候选内参基因，通过PCR检测共从中筛选出TEF2、RPII、18S、GAPDH、ACT、α-TUB、EFl-α-3、SAND-2、TUB、CYP2、RPL13共11个基因的引物能在甜樱桃基因组中扩增到目的条带，满足内参基因筛选的首要条件。2、对提取RNA的常规CTAB法进行缩短水浴的时间、延长离心和沉淀的时间、增加抽提次数等措施进行优化，得到了完整性好，无降解，纯度高的甜樱桃各样品RNA，28S和18S条带分离清楚，条带整齐无降解，能满足实验的要求。3、在甜樱桃营养器官中，geNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件的分析结果一致。geNorm的分析结果显示内参基因表达的稳定性排列顺序为SAND-2=RPL13> α-TUB> CYP2> ACT> EF1-α-3> TEF2> RPII> TUB>18S> GAPDH，NormFinder的分析结果为：RPL13> CYP2=EF1-α-3> ACT> TEF2> α-TUB> SAND-2> RPII> TUB>18S>GAPDH。BestKeeper显示最稳定内参基因的是18S和CYP2。结合三个软件的分析，在甜樱桃的营养器官中，最适宜作为内参的基因是CYP2。4、在甜樱桃生殖器官中，geNorm、NormFinder和BestKeeper三个软件的结果不尽相同，geNorm分析显示内参基因的稳定顺序为TEF2=CYP2>18S> SAND-2> ACT>EFI-α-3> α-TUB> RPL13> TUB> RPII> GAPDH，NormFinder分析的结果为ACT> TUB> SAND-2> α-TUB> CYP2> EF1-α-3>18S> TEF2> RPII> RPL13> GAPDH。BestKeeper显示较为稳定的是18S和α-TUB。综合比较分析，推荐SAND-2、CYP2和α-TUB作为内参使用。5、在甜樱桃逆境处理中，geNorm和NormFinder的分析结果基本一致，BestKeeper的结果有所不同，geNorm分析显示内参基因的稳定顺序为：EF1-α-3=RPII> CYP2> TEF2>18S> RPL13> ACT> TUB> GAPDH> SAND-2> α-TUB。NormFinder的分析结果为18S>EF1-α-3> CYP2> RPII> RPL13> TEF2> ACT> TUB> GAPDH> SAND-2> α-TUB。BestKeeper软件分析结果显示，所有基因中表现较为稳定的是18S和GAPDH。综合考虑EF1-α-3、CYP2和RPII为比较稳定的内参基因，推荐使用。6、在甜樱桃的所有样品中，geNorm和NormFinder软件的分析结果一致，geNorm显示在所有的样品中，表达的稳定性排序为：TEF2=CYP2> EF1-α-3> RPII>18S> SAND-2>ACT> α-TUB> RPL13> TUB> GAPDH。NormFinder的分析结果为CYP2> EF1-α-3>18S> ACT> SAND-2> RPII> TEF2> RPL13> TUB> α-TUB> GAPDH，而BestKeeper的结果显示只有18S是可用的，综合分析后在所有的样品中推荐CYP2作为稳定的内参使用。

全文目录

致谢  4-8
缩写词  8-9
摘要  9-11
1 文献综述  11-19
  1.1 内参基因概述  11-17
    1.1.1 内参基因的研究背景  11-12
    1.1.2 内参基因的研究动态  12-16
    1.1.3 内参基因的研究前景  16-17
  1.2 内参基因的筛选方法  17-19
2 引言  19-20
3 材料与方法  20-33
  3.1 试验材料  20-23
    3.1.1 植物材料  20-21
      3.1.1.1 营养器官材料  20
      3.1.1.2 生殖器官材料  20
      3.1.1.3 逆境处理材料  20-21
    3.1.2 供试仪器与试剂  21-23
      3.1.2.1 主要仪器设备  21
      3.1.2.2 主要药品和试剂  21-22
      3.1.2.3 试剂的配制  22-23
  3.2 试验方法  23-33
    3.2.1 引物设计  23-27
    3.2.2 引物的筛选  27-28
      3.2.2.1 DNA 的提取  27
      3.2.2.2 PCR 扩增  27
      3.2.2.3 电泳检测  27-28
    3.2.3 RNA 的提取  28-30
      3.2.3.1 异硫酸氰胍法提取 RNA  28-29
      3.2.3.2 CTAB 法提取 RNA  29-30
    3.2.4 RNA 浓度与纯度检测  30
    3.2.5 RNA 的完整性检测  30
    3.2.6 反转录  30-31
    3.2.7 荧光定量 RT-PCR  31
    3.2.8 结果统计  31-33
4 结果分析  33-47
  4.1 DNA 的提取  33
  4.2 引物的筛选  33-34
  4.3 RNA 提取方法的筛选  34-36
    4.3.1 异硫氰酸胍法提取 RNA 的结果  34
    4.3.2 CTAB 法提取 RNA 的结果  34-35
    4.3.3 CTAB 法的改良  35-36
  4.4 反转录结果分析  36-37
  4.5 内参基因的筛选  37-47
    4.5.1 所有样品中 11 个内参基因 Ct 值分析  37-38
    4.5.2 营养器官的结果分析  38-40
      4.5.2.1 geNorm 分析  38-39
      4.5.2.2 NormFinder 分析  39-40
      4.5.2.3 BestKeeper 分析  40
    4.5.3 生殖器官的结果分析  40-42
      4.5.3.1 geNorm 分析  40-41
      4.5.3.2 NormFinder 分析  41-42
      4.5.3.3 BestKeeper 分析  42
    4.5.4 逆境处理的结果分析  42-44
      4.5.4.1 geNorm 分析  42-43
      4.5.4.2 NormFinder 分析  43-44
      4.5.4.3 BestKeeper 分析  44
    4.5.5 所有样品的分析  44-47
      4.5.5.1 geNorm 分析  44-45
      4.5.5.2 NormFinder 分析  45-46
      4.5.5.3 BestKeeper 分析  46-47
5 结论与讨论  47-51
  5.1 结论  47
    5.1.1 引物的筛选  47
    5.1.2 甜樱桃 RNA 的提取方法  47
    5.1.3 内参基因的筛选结果  47
      5.1.3.1 营养器官  47
      5.1.3.2 生殖器官  47
      5.1.3.3 逆境处理  47
      5.1.3.4 所有样品  47
  5.2 讨论  47-51
    5.2.1 RNA 的提取  47-48
    5.2.2 对影响荧光定量结果的关键因素的探讨  48
    5.2.3 内参基因筛选  48-49
      5.2.3.1 营养器官的内参基因  48
      5.2.3.2 生殖器官的内参基因  48-49
      5.2.3.3 逆境处理条件下甜樱桃的内参基因  49
      5.2.3.4 所有样品的内参基因  49
    5.2.4 荧光定量结果的讨论  49-51
参考文献  51-55
Abstract  55-56

甜樱桃内参基因的筛选

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