学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

平邑甜茶新根细胞死亡及其抗凋亡基因的表达研究

作　者: 樊树雷
导　师: 杨洪强
学　校: 山东农业大学
专　业: 果树学
关键词: 平邑甜茶 MhBI-1 抗凋亡基因 2,4-D 干湿交替
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
下　载: 14次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

平邑甜茶（Malus hupehensis(Pamp)Rehd.var pinyiensis Jiang）是我国特有的苹果砧木。本研究以平邑甜茶为试材，结合苹果基因组数据库http://genomics.research.iasma.it/，克隆了平邑甜茶MhBI-1基因的完整编码区序列，分析了其基因序列与编码蛋白的性质和功能，并成功构建了MhBI-1基因正反义表达载体；同时获取了苹果MdBI-1s家族基因序列，研究了它们在苹果不同品种、不同组织以及在平邑甜茶根不同生长时期及高温胁迫下的表达情况。此外，还研究了平邑甜茶新根（延长根和吸收根）抗凋亡基因MhBI-1、MhBAG、MhHSP70在正常管理、2,4-D及干湿交替作用下的表达情况。主要结果如下：1）获得了平邑甜茶MhBI-1基因，该基因编码区序列长747bp，编码248个氨基酸，GenBank登录号为KC456613。2）获得了苹果MdBI-1s家族基因，该基因家族共有10个基因，构建了该基因家族系统进化树，并对其表达特征进行了半定量测定。半定量RT-PCR结果表明，MdBI-1s表达有一定的相似性，在茎中的表达高于叶和根；在新疆野苹果中的表达高于山定子、平邑甜茶和八棱海棠。在幼苗阶段，随生长时间，MdBI-1s表达呈现先上升后下降趋势，六叶龄期时达到高峰；42℃高温胁迫下，MdBI-1s表达随胁迫程度的加剧呈现先上升后下降趋势，2h时到达高峰。3）构建了pET-30a-MhBI-1原核表达载体，进行了原核表达试验，测定MhBI-1蛋白大小约为25kD。4）构建了pBI121-MhBI-1正反义表达载体，通过花序侵染法转化拟南芥得到T0代种子。5）正常生长时，吸收根细胞死亡率及相关代谢活性：根系活力、ATP含量和类caspase3/7活性变化呈现波动性，相对于延长根，其水平高且变化频率快，抗凋亡基因MhHSP70、MhBI-1和MhBAG在吸收根中表达也呈现相似的特点，反映了吸收根生命周期短，更新速度快与代谢活跃的特点。延长根变化相对稳定，呈现“台阶式变化”，活跃期后呈现出生长抑制阶段，在这个过程中，延长根MhHSP70、MhBI-1基本处于被抑制状态，MhBAG出现了明显的表达高峰，这可能与延长根的生长状态有关。6）在2,4-D及干湿交替作用下，新根出现了细胞死亡率及类caspase3/7活性升高，ATP含量及根活力下降，抗凋亡基因表达升高的趋势。抗凋亡基因的高表达有利于减少细胞凋亡的发生；在抗凋亡基因表达高峰时，延长根抗凋亡基因升高倍数明显高于吸收根，暗示延长根有更好的抗凋亡能力。在2,4-D处理早期，吸收根细胞死亡率的上升倍数与根系活力的下降幅度均高于延长根；干湿交替作用过程中，复水后延长根细胞死亡率变化相比吸收根呈现滞后性，这些说明吸收根对2,4-D和干湿交替的反应比延长根灵敏。

全文目录

英文缩写符号及中英文对照表  4-9
中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
1 前言  13-19
  1.1 细胞程序性死亡的分类及其特征  13-14
  1.2 细胞程序性死亡发生的调控  14-16
    1.2.1 Caspase 细胞死亡执行者  14-15
    1.2.2 Bcl-2 家族细胞死亡的调节阀  15-16
  1.3 细胞程序性死亡相关基因及其功能  16-18
    1.3.1 BI-1 的结构与功能  16
    1.3.2 HSP70 的结构与功能  16-17
    1.3.3 BAG 的结构与功能  17-18
  1.4 本研究目的和意义  18-19
2 材料与方法  19-32
  2.1 试验材料  19-21
    2.1.1 试材  19
    2.1.2 菌株与质粒  19
    2.1.3 酶及生化试剂  19
    2.1.4 PCR 引物  19-21
  2.2 试验处理  21
    2.2.1 不同品种、组织苹果砧木处理  21
    2.2.2 不同生长时期处理  21
    2.2.3 高温胁迫处理  21
    2.2.4 正常生长管理处理  21
    2.2.5 2,4-D 处理  21
    2.2.6 干湿交替处理  21
  2.3 试验方法  21-32
    2.3.1 平邑甜茶总 RNA 的提取  21-22
    2.3.2 RT-PCR 反转录合成 cDNA  22
    2.3.3 MhBI-1 序列的扩增  22-24
      2.3.3.1 PCR 扩增 MhBI-1 保守序列  22-23
      2.3.3.2 3'-RACE 扩增 3' 端序列  23
      2.3.3.3 琼脂糖凝胶电泳  23
      2.3.3.4 测序分析  23-24
    2.3.4 DNA 片段与克隆载体的连接  24
    2.3.5 制备和转化大肠杆菌感受态细胞  24
      2.3.5.1 制备大肠杆菌感受态细胞  24
      2.3.5.2 大肠杆菌感受态细胞的转化  24
    2.3.6 质粒 DNA 的提取  24-25
    2.3.7 凝胶电泳中 DNA 片段的回收  25
    2.3.8 质粒 DNA 的酶切鉴定  25-26
    2.3.9 目的片段与表达载体的连接  26
    2.3.10 基因测序  26
    2.3.11 pET-30a-MhBI-1 原核表达载体的构建  26-27
    2.3.12 原核表达重组菌株的诱导表达及电泳分析  27
    2.3.13 pBI121-正义/反义表达载体的构建  27-28
    2.3.14 制备与转化根癌农杆菌 GV3101 感受态细胞  28
      2.3.14.1 制备根癌农杆菌 GV3101 感受态细胞  28
      2.3.14.2 冻融法转化农杆菌  28
    2.3.15 拟南芥转化及转化植株的 PCR 鉴定  28-29
      2.3.15.1 拟南芥转化  28-29
      2.3.15.2 转基因植株筛选及鉴定  29
    2.3.16 半定量 RT-PCR 分析  29
    2.3.17 实时荧光定量 PCR 鉴定  29-30
    2.3.18 生物信息学分析  30
    2.3.19 细胞死亡率测定  30-31
    2.3.20 类 caspases3/7 蛋白酶活性检测  31
    2.3.21 根活力测定  31
    2.3.22 ATP 含量测定  31-32
3 结果与分析  32-48
  3.1 平邑甜茶抗凋亡基因 MhBI-1 克隆及其表达分析  32-39
    3.1.1 MhBI-1 基因的克隆与序列分析  32-33
      3.1.1.1 MhBI-1 保守序列的分离  32
      3.1.1.2 MhBI-13’片段的分离  32
      3.1.1.3 MhBI-1 基因的获得  32-33
    3.1.2 平邑甜茶 MhBI-1 编码蛋白的结构分析  33-35
      3.1.2.1 MhBI-1 蛋白的保守域分析  33-34
      3.1.2.2 部分植物 BI-1 蛋白序列多重比对  34
      3.1.2.3 MhBI-1 蛋白的系统进化树分析  34
      3.1.2.4 MhBI-1 蛋白的理化性质分析  34-35
      3.1.2.5 MhBI-1 蛋白的信号肽分析  35
      3.1.2.6 MhBI-1 蛋白跨膜结构域预测  35
      3.1.2.7 MhBI-1 蛋白亚细胞定位分析  35
      3.1.2.8 MhBI-1 蛋白的二级结构预测  35
    3.1.3 MhBI-1 原核表达分析  35-36
      3.1.3.1 MhBI-1 原核表达载体的构建及原核表达  35-36
    3.1.4 MhBI-1 植物表达载体构建及转化拟南芥  36-37
    3.1.5 MdBI-1s 基因家族表达分析  37-39
      3.1.5.1 MdBI-1s 在四种苹果砧木根、茎和叶中的表达  38
      3.1.5.2 MdBI-1s 在平邑甜茶根生长发育过程中的表达  38-39
      3.1.5.3 高温胁迫下平邑甜茶根 MdBI-1s 的表达  39
  3.2 平邑甜茶吸收根和延长根细胞死亡及其抗凋亡基因表达  39-42
    3.2.1 平邑甜茶延长根和吸收根细胞死亡率变化  39-40
    3.2.2 平邑甜茶延长根和吸收根细胞死亡相关代谢变化  40-41
      3.2.2.1 平邑甜茶延长根和吸收根根系活力的变化  40
      3.2.2.2 平邑甜茶延长根和吸收根 ATP 含量的变化  40
      3.2.2.3 平邑甜茶延长根和吸收根类 caspase3/7 活性变化  40-41
    3.2.3 平邑甜茶延长根和吸收根 MhBI-1 表达变化  41
    3.2.4 平邑甜茶延长根和吸收根 MhHSP70 表达变化  41-42
    3.2.5 平邑甜茶延长根和吸收根 MhBAG 表达变化  42
  3.3 2,4-D 对新根细胞死亡及抗凋亡基因表达的调节  42-45
    3.3.1 新根细胞死亡率对 2,4-D 的响应  42-43
    3.3.2 新根细胞死亡相关代谢对 2,4-D 的响应  43
      3.3.2.1 新根根系活力对 2,4-D 的响应  43
      3.3.2.2 新根 ATP 含量对 2,4-D 的响应  43
      3.3.2.3 新根类 caspase3/7 活性对 2,4-D 的响应  43
    3.3.3 新根 MhBI-1 对 2,4-D 的响应  43-44
    3.3.4 新根 MhHSP70 对 2,4-D 的响应  44
    3.3.5 新根 MhBAG 对 2,4-D 的响应  44-45
  3.4 干湿交替作用下新根细胞死亡及抗凋亡基因表达  45-48
    3.4.1 干湿交替作用下新根细胞死亡率变化  45
    3.4.2 干湿交替作用下新根细胞死亡相关代谢的变化  45-47
      3.4.2.1 干湿交替作用下新根根系活力的变化  45-46
      3.4.2.2 干湿交替作用下新根 ATP 含量的变化  46
      3.4.2.3 干湿交替作用下新根类 caspase3/7 活性变化  46-47
    3.4.3 干湿交替作用下新根 MhBI-1 表达变化  47
    3.4.4 干湿交替作用下新根 MhHSP70 表达变化  47
    3.4.5 干湿交替作用下新根 MhBAG 表达变化  47-48
4 讨论  48-51
  4.1 平邑甜茶 MhBI-1 基因的克隆及表达分析  48-49
    4.1.1 平邑甜茶 MhBI-1 基因的克隆及生物信息学、原核表达分析  48
    4.1.2 苹果 MdBI-1s 表达分析  48-49
  4.2 平邑甜茶新根细胞死亡及其基因表达  49-51
    4.2.1 平邑甜茶新根在正常管理下的死亡及其基因表达  49-50
    4.2.2 2,4-D 及干湿交替作用下平邑甜茶新根死亡及其基因表达  50-51
5 结论  51-52
参考文献  52-61
致谢  61-62
攻读硕士学位期间发表论文情况  62

平邑甜茶新根细胞死亡及其抗凋亡基因的表达研究

内容摘要

全文目录

相似论文