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番茄LeGSH1基因的克隆及在耐镉性中的功能分析

作　者: 王晓
导　师: 史庆华
学　校: 山东农业大学
专　业: 蔬菜学
关键词: γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶番茄镉胁迫谷胱甘肽过表达
分类号: S641.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

谷胱甘肽是植物中重要的抗氧化物质，在植物抵御各种胁迫中发挥着重要的作用。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-ECS）在植物谷胱甘肽合成中起着关键的作用。镉是危害植物生长发育的有害元素，土壤中过量的镉会对植物生长发育产生明显的危害。大量的试验表明谷胱甘肽在植物抵御镉胁迫中发挥着重要的作用。本试验以番茄为研究材料，研究过表达γ-ECS番茄在镉胁迫中响应，结果如下：1.根据已知的番茄基因组，从番茄叶片克隆得到了编码γ-ECS序列的cDNA全长，并命名为LeGSH1。半定量分析表明，LeGSH1在番茄不同的组织中都有表达，包括根，茎，叶，花和果实。为了确定LeGSH1是否参与番茄对镉毒害的耐受性，将LeGSH1成功转入番茄植株中，得到了过表达LeGSH1转基因番茄植株。Southern blot分析表明，从转基因植物中提取的DNA样品中检测到较强信号，而野生型植物没有检测到信号，镉胁迫下转基因株系与野生型（WT）相比，LeGSH1的表达也有显著的提高，证明LeGSH1已成功转到番茄基因组中并可以在番茄叶片中过表达。2.与野生型番茄相比，过表达LeGSH1显著缓解了由镉诱导的番茄叶片失绿症状，同时色素含量增加，有效减少了活性氧（ROS）的积累，从而比野生型受到较低的氧化胁迫。叶片中LeGSH1这种功能可以归因于较高的GSH累积从而降低了Cd在叶片中的积累。进一步分析表明，与野生型番茄相比，过表达LeGSH1的转基因番茄的叶片中积累了更多的铁、钙和铜，表明镉胁迫下过表达LeGSH1在维持养分平衡中也发挥了重要作用。

全文目录

符号说明  4-9
中文摘要  9-10
Abstract  10-11
1 前言  11-24
  1.1 植物体内谷胱甘肽合成及生物学功能概述  11-16
    1.1.1 谷胱甘肽的生物合成  11-12
    1.1.2 谷胱甘肽合成的调节  12
    1.1.3 谷胱甘肽在植物中生长发育中的作用  12-13
    1.1.4 谷胱甘肽在植物生物胁迫下的作用  13
    1.1.5 谷胱甘肽在植物非生物胁迫下的作用  13-15
    1.1.6 过表达谷胱甘肽合成相关酶的研究进展  15-16
  1.2 镉胁迫的毒害机理概述  16-18
    1.2.1 镉对植物生长的影响  16
    1.2.2 镉在植物体内的吸收及其转运  16-17
    1.2.3 镉胁迫与活性氧代谢  17-18
    1.2.4 植物对镉胁迫的响应机制  18
  1.3 谷胱甘肽在重金属胁迫中的作用  18-22
  1.4 本试验研究目的及意义  22-24
2 材料与方法  24-37
  2.1 材料处理  24-25
  2.2 表达载体的构建  25-29
    2.2.1 总 RNA 的提取  25-26
    2.2.2 cDNA 第一链的合成  26
    2.2.3 PCR 扩增获得目的片段  26-27
    2.2.4 目的片段连接到克隆载体  27
    2.2.5 大肠杆菌的转化  27
    2.2.6 重组质粒的筛选与鉴定  27-28
    2.2.7 重组质粒插入片段方向的酶切鉴定  28
    2.2.8 目的片段连入表达载体 pBI121  28-29
    2.2.9 LeGSH1 基因的生物信息学分析  29
    2.2.10 LeGSH1 基因的时空表达和逆境响应  29
  2.3 农杆菌介导的番茄叶片的遗传转化  29-34
    2.3.1 农杆菌感受态细胞的制备  29
    2.3.2 农杆菌的转化  29-30
    2.3.3 农杆菌介导的番茄外源基因转化  30-31
    2.3.4. 组培苗的检测  31-34
  2.4 镉胁迫下过表达 LeGSH1 转基因植株的指标测定  34-36
    2.4.1 干鲜重的测定  34
    2.4.2 叶片中叶绿素含量的测定  34
    2.4.3 叶片中 LeGSH1 基因表达量的测定  34
    2.4.4 叶片中谷胱甘肽含量的测定  34-35
    2.4.5 叶片中丙二醛含量的测定  35
    2.4.6 叶片中 H_2O_2和 O_2~(.-)含量的测定  35
    2.4.7 叶片中镉、钙、镁、铁和铜含量的测定  35-36
  2.5 统计分析  36-37
3 结果与分析  37-49
  3.1 目的基因片段的克隆与表达载体的构建  37-41
    3.1.1 目的基因的克隆  37
    3.1.2 表达载体的构建与检测  37-38
    3.1.3 番茄 LeGSH1 基因的生物信息学分析  38-40
    3.1.4 番茄 LeGSH1 基因的时空表达和逆境响应  40-41
  3.2. 番茄的遗传转化及检测  41-42
    3.2.1 番茄的遗传转化  41
    3.2.2 转基因植株的 PCR 检测  41-42
    3.2.3 Southern blot 检测转基因植株  42
  3.3 镉胁迫对转基因番茄的影响  42-49
    3.3.1 番茄叶片的表观症状  42-43
    3.3.2 对番茄叶片 LeGSH1 表达量的影响  43
    3.3.3 对番茄叶片 GSH 含量的影响  43-44
    3.3.4 对番茄叶片叶绿素含量的影响  44-45
    3.3.5 对番茄植株干鲜重的影响  45
    3.3.6 对叶片中 O_2~(.-)和 H_2O_2含量的影响  45-46
    3.3.7 对叶中丙二醛含量的影响  46-47
    3.3.8 对叶中镉、镁、钙、铁、铜含量的影响  47-49
4 讨论  49-52
  4.1 番茄 LeGSH1 基因的时空表达和逆境响应  49
  4.2 LeGSH1 转基因番茄在镉胁迫下的响应  49-52
5 结论  52-53
参考文献  53-74
附录  74-76
致谢  76-77
攻读学位期间发表论文情况  77

番茄LeGSH1基因的克隆及在耐镉性中的功能分析

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