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棉花（Gossypium hirsutum）RAV1基因克隆鉴定及功能研究

作　者: 李晓洁
导　师: 李学宝
学　校: 华中师范大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 棉花 RAV蛋白转录激活亚细胞定位胁迫基因过量表达 RNA干涉(RNAi)
分类号: S562
类　型: 硕士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

高盐和干旱等非生物胁迫是影响植物生长发育的重要限制因素。因此,通过各种生物学技术手段研究农作物在胁迫条件下的生长和调控机制,进而提高农业效益,具有重要理论意义和应用价值。棉花(Gossypium hirsutum)是世界上重要的经济作物,其产生的棉纤维和棉籽油与人们的日常生活密切相关,但是,由于我国大面积存在的盐碱地及许多地区经常性干旱等恶劣气候条件等各种因素的影响,限制了我国的棉花生产,甚至导致棉花减产减收。目前,关于棉花胁迫应答和ABA信号调控机制方面的报道较少,有必要进一步探讨,提供较为详细的科学资料,应用于棉花抗逆育种研究。RAV类蛋白是AP2蛋白家族的一个亚类,在植物胁迫应答及激素应答方面起关键的调控作用。AP2家族根据所含结构域的数目,可分为AP2亚家族(包含两个AP2结构域),和EREBP家族(包含一个AP2结构域)。植物RAV蛋白含有一个植物所特有的AP2和一个B3结构域,属于EREBP家族。我们从棉花cDNA文库中分离得到一个编码RAV类蛋白的基因(cDNA),命名为GhRAV1。初步研究表明,GhRAV1蛋白和其他RAV类蛋白一样,具有保守的结构域,含有AP2和B3结构域,同时具备核定位特性。该基因在棉花营养组织中表达量较高,且受干旱、高盐和ABA的诱导。同时,该基因的表达受外源的BL影响,可能与BR信号相关。本文主要在基因和蛋白质结构、表达模式、转录激活活性、蛋白亚细胞定位、胁迫应答以及与BR信号相关性等方面来研究和阐述GhRAV1的功能,取得如下研究结果：1.GhRAV1基因的分离鉴定与进化分析从棉花cDNA文库中分离鉴定了1个编码RAV类蛋白的基因,命名为GhRAV1。 GhRAV1含有1074bp的开放阅读框(ORF),编码一个由358个氨基酸组成的分子量为37.8kD的蛋白。GhRAV1蛋白结构包括一个AP2结构域和一个B3结构域,属于RAV亚家族成员。进化分析表明,GhRAV1蛋白与烟草NtRAV蛋白、拟南芥AtRAV2、川椒CaRAV1同源性较高,亲缘关系较近。2. GhRAV1基因受ABA、NaCl和PEG诱导表达荧光定量RT-PCR分析表明,GhRAV1基因在棉花不同组织中均有表达,在根、子叶、真叶和开花后9天(9DPA)的纤维中表达量较高,而在下胚轴、花药、花瓣、胚珠,以及0-6DPA、12-18DPA纤维细胞中表达量较低,这说明该基因在棉花组织中呈现组成型表达特点。分别用脱落酸(ABA)、NaCl和聚乙二醇(PEG)处理棉花幼苗5天,然后提取棉花不同组织的总RNA,通过实时荧光定量RT-PCR分析GhRAV1基因的表达情况。结果表明,GhRAV1在ABA、NaCl和PEG处理条件下被诱导表达。与对照相比,处理后的基因表达量显著上升。3. GhRAV1蛋白转录自激活和亚细胞定位分析构建GhRAV1基因表达载体pGBKT7-RAV1,转化酵母AH109和Y187菌株,研究该蛋白是否具有转录自激活活性。研究结果显示,GhRAV1蛋白不具备转录自激活活性。以eGFP为报告基因,构建pEI-GhRAV1-eGFP融合表达载体,用注射法转化烟草叶表皮细胞,共培养48小时后,在共聚焦显微镜下观察烟草叶表皮细胞的绿色荧光,结果显示,GFP荧光主要分布在细胞核内。这表明GhRAV1蛋白定位于细胞核。4. GhRAV1过量表达导致转基因拟南芥对干旱和高盐胁迫的敏感性增加为研究GhRAV1蛋白在植物中的功能,通过构建pMD-GhRAV1过量表达载体,转化拟南芥后,对其进行抗性分析。植物的胁迫应答可能通过依赖ABA和不依赖ABA两种途径。因此,我们选用ABA、NaCl和PEG处理转基因拟南芥幼苗,进行相关分析。结果发现,GhRAV1过量表达的转基因拟南芥植株对盐和干旱的敏感性增强,而且,与植株对ABA敏感性一致,因而推测GhRAV1可能是通过依赖ABA途径来参与转基因拟南芥植株对干旱和高盐胁迫的应答过程。我们通过定量RT-PCR分析了胁迫相关基因在GhRAVl转基因拟南芥中的表达情况,结果表明RAB18, RD29B, ABI1, ERD15, KIN1在转基因拟南芥中表达上调,而Cor15a8, RD29A, RCI表达下调,推测GhRAVl可能通过调节这些基因的表达变化来影响转基因植株对干旱和盐胁迫的耐性。5. GhRAVl过量表达转基因拟南芥对BR信号的应答对GhRAV1过量表达转基因拟南芥幼苗进行外源BL处理。结果发现,在BL处理条件下,GhRAV1过量表达转基因拟南芥根伸长快于野生型,由此推测GhRAV1可能也参与BR信号通路。6.转基因棉花植株的获得及初步分析鉴定我们还对另一个AP2基因(GhAP2)进行了一些研究。构建了pMD-GhAP2RNAi融合表达载体,获得转基因棉花植株。对其中已经种植的T0代转基因棉花进行了DNA和RNA水平的鉴定,进而对其开花后1天的阳性植株进行离体胚珠培养实验。结果表明,GhAP2RNAi转基因棉花离体胚珠受外源ACC影响较大,但也不排除组培过程对T0代植株的影响。因此,需要进一步对转基因棉花后代植株进行遗传分析。另外,考虑到该基因可能参与乙烯应答,过量表达或抑制表达可能会影响棉花开花结实,因此,我们继续进行棉花遗传转化,目前已获得大批愈伤组织,正在继代培养中,期望能够在近期再生成苗,获得新的转基因棉花植株。

全文目录

摘要  6-9
Abstract  9-15
一、引言  15-30
  1.1 植物逆境胁迫应答与ABA信号转导  15-24
    1.1.1 植物适应逆境胁迫的信号通路研究  15-17
    1.1.2 植物适应盐胁迫的分子机制  17-19
    1.1.3 植物干旱胁迫机制  19-23
    1.1.4 ABA和非生物胁迫信号  23-24
  1.2 AP2家族转录因子研究进展  24-29
    1.2.1 GhRAV1在逆境胁迫应答方面的进展情况  25-26
    1.2.2 GhRAV1在BR应答方面的进展情况  26-28
    1.2.3 GhAP2蛋白的研究进展情况  28-29
  1.3 立题依据和研究意义  29-30
二、材料与方法  30-44
  2.1 实验材料  30-35
    2.1.1 植物材料  30
    2.1.2 菌种和质粒  30
    2.1.3 工具酶  30
    2.1.4 常用储存液  30
    2.1.5 常用缓冲液  30-31
    2.1.6 常用培养基(细菌培养、植物培养)  31-34
    2.1.7 PCR扩增所需试剂  34
    2.1.8 离体胚所需培养基(BT培养基)  34
    2.1.9 树脂切片所需试剂  34
    2.1.10 烟草表皮细胞注射液  34-35
    2.1.11 仪器设备  35
  2.2 实验方法  35-44
    2.2.1 基因及蛋白序列分析  35-36
    2.2.2 组织表达分析  36-38
    2.2.3 胁迫处理情况下基因表达量  38
    2.2.4 分离目的基因  38
    2.2.5 载体构建方法及连接转化  38
    2.2.6 大肠杆菌(E.coli-DH5α)、农杆菌(LBA4404、GV3101)感受态细胞的制备及转化  38-39
    2.2.7 质粒DNA的提取(碱裂解法)  39
    2.2.8 GhRAV1亚细胞定位  39
    2.2.9 拟南芥表型分析  39-41
    2.2.10 棉花基因组GDNA的提取  41
    2.2.11 棉花不同组织RNA的提取  41
    2.2.12 棉花组织培养方法  41
    2.2.13 棉花离体胚培养方法  41
    2.2.14 酵母转录自激活检测方法  41-42
    2.2.15 GhRAV1蛋白与棉花基因组DNA Pull-down实验  42-44
三、实验结果  44-71
  3.1 GHRAV1蛋白结构及序列分析  44-47
    3.1.1 cDNA的分离与鉴定  44
    3.1.2 蛋白序列同源性分析  44-45
    3.1.3 GhRAV1蛋白同源进化分析  45-47
  3.2 GHRA1表达模式分析  47
  3.3 GHRA1基因在不同处理条件下的差异表达  47-49
    3.3.1 GhRAV1基因在胁迫条件下的差异表达(幼苗)  47-48
    3.3.2 GhRAV1基因在BL处理条件下的差异表达(纤维)  48-49
  3.4 GHRA1基因转录激活活性检测  49-51
    3.4.1 pGBKT7-GhRAV1表达载体的构建及酵母转化  49
    3.4.2 pGBKT7-GhRAV1转录激活活性检测  49-51
  3.5 GHRAV1蛋白的靶基因分离鉴定  51-53
    3.5.1 pet32a-GhRAV1融合表达载体的构建  51-52
    3.5.2 GhRAV1蛋白的诱导及纯化  52-53
    3.5.3 高纯度棉花基因组DNA的提取  53
    3.5.4 靶基因分离鉴定结果  53
  3.6 GHRAV1蛋白亚细胞定位分析  53-55
    3.6.1 pBI121-GhRAV1-GFP融合表达载体的构建  53-54
    3.6.2 pBI121-GhRAV1-GFP融合蛋白在烟草表皮细胞的荧光定位观察  54-55
  3.7 pMD-GHRAV1过量表达载体的构建及转基因植株的获得  55-57
    3.7.1 pMD-GhRAV1过量表达载体的构建  55
    3.7.2 pMD-GhRAV1过量表达拟南芥植株的鉴定  55-57
  3.8 GHRA1转基因拟南芥的胁迫表型分析  57-64
    3.8.1 GhRAV1转基因拟南芥对ABA的应答  57-59
    3.8.2 GhRAV1转基因拟南芥增强对盐胁迫的敏感性  59-62
    3.8.3 GhRAV1转基因拟南芥增强对干旱胁迫的敏感性  62-63
    3.8.4 GhRAV1过量表达转基因拟南芥中胁迫相关基因的表达分析  63-64
  3.9 GHRAV1转基因拟南芥的BR应答分析  64-66
    3.9.1 GhRAV1转基因拟南芥根长受BL影响  64-65
    3.9.2 GhRAV1转基因拟南芥根组织切片分析  65-66
  3.10 GHAP2 RNAI转基因棉花分析  66-71
    3.10.1 GhAP2基因在ACC处理下的差异表达  66
    3.10.2 pMD-35S：：GhAP2RNAi转基因棉花鉴定  66-67
    3.10.3 pMD-35S：：GhAP2RNAi转基因棉花的RNA水平鉴定  67-68
    3.10.4 ACC处理下,pMD-35S：：GhAP2RNAi转基因棉花的离体胚珠实验  68-69
    3.10.5 35S：：GhAP2RNAi转基因棉花的组培及继代培养  69-71
四、讨论  71-76
  4.1 GHRAV1结构及进化分析  71
  4.2 GHRAV1组织表达与转录抑制活性  71-72
  4.3 GHRAV1受干旱和高盐诱导表达  72
  4.4 一些胁迫相关基因可能受GHRAV1调节  72-73
  4.5 GHRAV1转基因拟南芥植株生理指标的改变  73-74
  4.6 GHRAV1可能参与BR信号应答  74
  4.7 GHAP2可能参与乙烯信号应答  74-76
参考文献  76-83
硕士研究生期间发表的论文  83-84
附录：本文缩写符号  84-85
致谢  85-86

棉花（Gossypium hirsutum）RAV1基因克隆鉴定及功能研究

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