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水稻与RBSDV互作过程中OsRNase3功能的初步研究

作　者: 张晓霞
导　师: 周益军
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: OsRNase3 RBSDV Real-time PCR 载体构建酵母双杂交
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

植物的S-Like RNase是Ribonucleases T2家族的成员之一,不仅参与植物衰老和脱落等过程磷酸盐的重复利用,而且在防卫反应中起着重要作用,能抵抗病毒、真菌等病原物的侵染。水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)隶属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)第2组,主要侵染水稻、玉米、小麦等禾本科作物,为粮食生产带来严重的经济损失。本实验室前期通过蛋白质组学方法分析发现在RBSDV侵染后特异性表达。有研究报道OsRNase3能与RBSDV P5b互作。目前OsRNase3的功能还不明确,其在水稻与RBSDV互作过程中的作用有待研究。为此,本论文从以下三个方面进一步研究了OsRNase3在水稻与RBSDV互作过程中的作用。1.RBSDV侵染对寄主植物OsRNase3表达量的影响。为了明确RBSDV侵染对寄主植物OsRNase3表达的影响,本文采用Real-time PCR方法定量分析RBSDV侵染后水稻核糖核酸酶表达量的变化,同时分析了RBSDV侵染对另外两个寄主植物小麦和玉米中核糖核酸酶基因表达量的变化。此外,比较了水稻感病品种和抗病品种上接种RBSDV后OsRNase3表达量的差异。Real-time PCR分析结果表明,在水稻感病品种日本晴上接种RBSDV后,叶片和茎秆中OsRNase3mRNA表达量是对照的3.08倍、6.9倍；在感病品种淮稻5号上接种RBSDV后,叶片和茎秆中OsRNase3mRNA的表达量是对照的3.75倍和4.89倍。亲缘关系分析表明玉米和小麦中与OsRNase3亲缘关系最近的核糖核酸酶为ZmaRNS1和TaeRNS4。Real-time PCR分析结果表明,在玉米和小麦上接种RBSDV后,ZmaRNSl和TaeRNS4的mRNA表达量分别为对照的3.49和1.89倍。RBSDV侵染后,三种寄主植物的核糖核酸酶表达量均上调,表明核糖核酸酶可能在抗病毒过程中有重要作用。为分析OsRNase3勺表达量是否与RBSDV的积累量相关,我们分析了水稻不同部位病毒积累量和OsRNase3表达量之间的关系。结果表明,水稻品种日本晴和淮稻5号感染RBSDV后,RBSDV P10在茎秆中的积累量分别是叶片的13.1倍和5倍,而OsRNase3在茎秆中表达量分别是叶片的2.3倍和4.7倍。以上结果说明,水稻茎秆中病毒的积累量高于叶片,OsRNase3的表达量与病毒的积累量存在相关性,病毒积累量高的部位OsRNase3勺表达量也高,进一步表明OsRNase3在抗病毒过程中起重要作用。为分析OsRNase3是否与水稻抗RBSDV的特性相关,我们分析了感病品种日本晴和具有部分抗性的水稻品种津稻263在RBSDV侵染后OsRNase3表达量的变化。结果表明,日本晴接种RBSDV后,叶鞘、叶和茎中OsRNase3表达量分别是对照的4.1、5.6、8.1倍,津稻263品种接种RBSDV后,叶鞘、叶和茎中OsRNase3表达量是对照的5.2、6.1、9.6倍。抗病品种接种RBSDV后OsRNase3勺表达量高于感病品种,推测OsRNase3与水稻的抗病毒功能相关。2.构OsRNase3的过量表达植株和RNAi干扰植株研究OsRNase3的功能。为了进一步分析水稻OsRNase3的功能,本研究构建了pCAMBIA1301-OsRNase3和pCAMBIA1300-OsRNase3载体,用于转化水稻；构建了pCAMBIA1301-OsRNase3载体,用于转化烟草。PCR克隆500bp的OsRNase3基因片段,通过正向和反向连入中间载体中间载体pBluescript-intron,并最终连接至pCAMBIA1300,获得含有发夹结构的的RNAi沉默表达载体1300-OsRNase3-in-OsRNase3,用于转化水稻,进一步研究其功能。为了确定OsRNase3在植物亚细胞中的定位,构建了GFP融合蛋白表达载体1301-GFP-OsRNase3,转化农杆菌后浸润本氏烟,观察OsRNase3的亚细胞定位。3. OsRNase3与病毒蛋白之间的互作关系RBSDV S5的ORF2编码蛋白存在2种起始位点,两种不同起始位点的编码蛋白相差28个氨基酸。为研究位点差异与水稻互作的关系,我们分析了水稻中核糖核酸酶OsRNase3与两种不同起始位点的编码蛋白P5-2、P5-2△之间的互作。酵母双杂交结果显示,OsRNase3均能与P5-2、P5-2△发生互作,表明S5的ORF2编码蛋白的始位点与病毒的互作没有关系。为分析OsRNase3是否还与RBSDV的其他病毒存在互作,我们分析了OsRNase3与P7-1、P8、P9-1和P10的互作关系。结果表明OsRNS3与P7-1、P8、P9-1、P10均没有互作关系。表明RBSDV OsRNase3与P5-2互作可能是特异性的。

全文目录

摘要  6-8
ABSTRACT  8-11
第一章文献综述  11-25
  1 植物RNases T2家族的研究进展  11-18
    1.1 植物RNases T2家族的分类及特性  11-12
    1.2 植物RNases T2家族的功能  12-13
    1.3 水稻RNase T2家族的研究进展  13-18
  2 水稻黑条矮缩病毒的研究概况  18-22
    2.1 RBSDV的分类地位  18
    2.2 RBSDV病毒粒子及基因组  18-20
    2.3 RBSDV的症状特点  20-21
    2.4 水稻黑条矮缩病的发生与危害  21-22
  3 本课题研究的目的及意义  22-25
第二章 RBSDV侵染对寄主植物核糖核酸酶基因表达量的影响  25-41
  1 材料方法  26-30
    1.1 材料  26-27
    1.2 方法  27-30
  2 结果  30-37
    2.1 样品总RNA的质量检测  30-31
    2.2 RBSDV对水稻核糖核酸酶基因OsRNase3表达量的影响  31-34
    2.3 RBSDV对小麦核糖核酸酶基因TaeRNS4表达量的影响  34-35
    2.4 RBSDV对玉米核糖核酸酶基因ZmaRNS1表达量的影响  35-36
    2.5 RBSDV侵染后水稻抗病品种与感病品种OsRNase3的表达量差异  36-37
  3 讨论  37-41
第三章水稻核糖核酸酶OsRNase3功能的初步分析  41-53
  1 材料与方法  42-45
    1.1 实验材料  42-43
    1.2 实验方法  43-45
  2 结果与分析  45-51
    2.1 OsRNase3的RNAi载体构建  45-47
    2.2 过量表达载体构建  47-49
    2.3 GFP的融合表达载体的构建  49-51
  3 讨论  51-53
第四章水稻OsRNase3与RBSDV的互作分析  53-69
  1 材料与方法  54-62
    1.1 材料  54-55
    1.2 方法  55-62
  2 结果与分析  62-66
    2.1 酵母表达载体的构建  62-64
    2.2 OsRNase3与RBSDV蛋白的互作检测  64-66
  3 小结与讨论  66-69
参考文献  69-75
附录A 常用缓冲液及试剂配方  75-77
附录B 常用术语缩写  77-78
附录C 载体图谱  78-83
学术论文发表情况  83-85
致谢  85

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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