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荧光假单胞菌2P24抗生素合成基因转录及转录后调控因子的分析

作　者: 赵曌
导　师: 张力群
学　校: 中国农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 假单胞菌2P24 抗生素合成基因phlA GacA RsmA/E DsbA
分类号: S476
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

生防假单胞菌2P24(Pseudomonas fluorescens2P24)分离自山东小麦全蚀病自然衰退土壤,对多种病原菌引起的土传病害都具有良好的生防效果,产生抗生素2,4-二乙酰基间苯三酚(2,4-diacetylphloroglucinol,2,4-DAPG)是其主要的防病机制。2,4-DAPG由phlACBD基因簇合成,该基因簇的表达受多种调控因子在不同水平的直接或间接调控,其中阻遏蛋白RsmA/E是重要的转录后调控因子。本研究从phlA基因的启动子分析入手,构建了phlA基因启动子转录报告质粒体系,并通过筛选影响RsmA/E的上游调控因子,进一步分析抗生素2,4-DAPG合成调控因子的调控机制。首先,对2,4-DAPG合成基因簇的第一个基因phlA的启动子进行分析,根据分析结果,将该启动子序列截断为11个含有不同长度phlA启动子的片段,并与p970km转录报告质粒连接,构建成11个phlA基因启动子转录报告质粒,分别检测各个启动子在2P24菌株胞内的活性,发现phlA基因启动子中存在多个转录调控元件。再将这些启动子转录报告质粒分别电击进入实验室前期研究的转录调控因子突变菌株中,以探究这些转录调控因子在phlA基因启动子上的转录调控作用位点。实验结果显示上述不同转录调控因子的作用位点基本都与PhlF蛋白的作用位点相同,均作用于含有pho位点的序列481-530中。故进一步选取GacA因子为代表,探究其调控phlA基因转录的机制,结果表明GacA是通过影响了PhlF蛋白的转录调控作用从而表现出与之作用位点相同。故推测PhlF是影响phlA基因转录最主要的直接调控因子,而其他转录调控因子很可能是通过影响PhlF因子从而调控phlA基因转录。其次,本文将分别含有rsmA基因和rsmE基因转录报告质粒的菌株2P24作为出发菌株进行转座子Tn5随机突变,在大约3万个突变体中,筛选到了86个对调控蛋白基因转录影响较大的突变菌株,其中,18个突变菌株中报告质粒的活性升高,即突变体中被破坏的基因对rsmA/rsmE基因表达有负调控作用；68个突变菌株中报告质粒的活性降低,即突变体中被破坏的基因对rsmA/rsmE基因表达有正调控作用。被破坏的基因中,sacB基因编码一种核糖核酸酶R蛋白,能够负调控rsmA基因的转录。进一步测定vacB基因在菌株2P24中的功能发现其影响菌株2P24抗生素的产生、群体感应信号的生成及游动性等多种生理性状,表明其可能是调控菌株2P24生防能力的一个重要调控因子。另外,本研究对实验室前期筛选得到的一个负调控抗生素产生的周质蛋白DsbA的调控机制进行进一步研究发现,DsbA是在转录后水平负调控phl4基因的表达,这种调控是通过同时在转录水平和转录后水平正调控小蛋白RsmA的表达来实现的,从而最终影响了2,4-DAPG的产量。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章绪论  7-16
  1.1 文献综述  7-15
    1.1.1 荧光假单胞菌的生防机制  7-10
    1.1.2 抗生素2,4-DAPG的生物合成基因簇  10-11
    1.1.3 抗生素2,4-DAPG合成基因表达的调控  11-13
    1.1.4 DsbA的研究进展  13-15
  1.2 研究目的和意义  15
  1.3 研究内容  15-16
第二章菌株2P24抗生素2,4-DAPG合成基因phlA启动子及其转录表达调控的分析  16-42
  2.1 材料与方法  16-26
    2.1.1 菌株、载体及培养条件  16-18
    2.1.2 试剂材料  18-19
    2.1.3 DNA操作方法  19-21
    2.1.4 phlA基因启动子报告质粒的构建  21-24
    2.1.5 β-半乳糖苷酶酶活测定  24
    2.1.6 突变体的构建  24-25
    2.1.7 PhlF蛋白的表达及纯化  25
    2.1.8 PhlF蛋白抗体的制备  25-26
    2.1.9 Western Blotting  26
  2.2 结果与分析  26-39
    2.2.1 phlA启动子序列的分析  26-28
    2.2.2 不同长度phlA基因启动子在胞内的活力测定  28-29
    2.2.3 不同长度phlA基因启动子在各个转录调控因子突变体中的活力测定  29-35
    2.2.4 转录调控因子对PhlF蛋白表达的影响  35-36
    2.2.5 GacA因子调控phlA基因转录的机制  36-39
  2.3 结论与讨论  39-42
第三章菌株2P24中调控蛋白RsmA、RsmE上游转录调控因子的筛选  42-59
  3.1 材料与方法  42-46
    3.1.1 菌株、载体与培养条件  42-43
    3.1.2 DNA操作方法  43-44
    3.1.3 调控蛋白RsmA、RsmE上游调控基因的筛选和克隆  44-45
    3.1.4 vacB基因缺失突变菌株和互补菌株的构建  45
    3.1.5 2,4-DAPG的提取与检测  45
    3.1.6 报告菌平板的制备及信号检测  45-46
    3.1.7 游动性与生物膜的测定  46
  3.2 结果与分析  46-56
    3.2.1 Tn5转座诱变及突变子的筛选  46-47
    3.2.2 突变子侧翼序列的克隆  47-48
    3.2.3 菌株2P24中vacB基因的鉴定及缺失突变体的构建  48-50
    3.2.4 VacB对菌株2P24在低温条件下生长的影响  50-51
    3.2.5 VacB对抗生素产量及其合成基因phlA的影响  51
    3.2.6 VacB对小RNA及调控蛋白RsmA/E的调控  51-53
    3.2.7 VacB对菌株信号分子的产生及AHL信号合成基因pcoI的影响  53-55
    3.2.8 VacB对菌株游动性及生物膜形成的影响  55-56
  3.3 结论与讨论  56-59
第四章荧光假单胞杆菌2P24周质蛋白DsbA通过小蛋白RsmA调控抗生素产量  59-72
  4.1 材料与方法  59-63
    4.1.1 菌株、质粒和培养条件  59-61
    4.1.2 DNA操作方法  61-62
    4.1.3 突变菌株的构建  62
    4.1.4 2,4-DAPG、MAPG和PG的提取与检测  62
    4.1.5 β-半乳糖苷酶活性的测定  62-63
    4.1.6 Western印记杂交  63
    4.1.7 平板拮抗能力的测定  63
  4.2 结果与分析  63-70
    4.2.1 DsbA对抗生素产量的影响  63-64
    4.2.2 DsbA对2,4-DAPG合成基因phlA表达的影响  64-65
    4.2.3 DsbA通过调控小蛋白RsmA影响phlA基因的表达  65-67
    4.2.4 RsmA的自我正反馈调控  67
    4.2.5 DsbA对RsmA的转录调控是间接的  67-68
    4.2.6 DsbA与小蛋白RsmA/E的互作  68-69
    4.2.7 双因子系统PhoQ/PhoP对菌株2P24拮抗活性的影响  69-70
  4.3 结论与讨论  70-72
第五章结论  72-74
参考文献  74-85
附录  85-87
致谢  87-89
作者简历  89

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