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番茄土传病害拮抗菌的筛选、鉴定及其防病机理初探

作　者: 梁雪杰
导　师: 陆凡；陈志谊
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 番茄青枯病 番茄枯萎病 拮抗细菌 抗菌物质 定殖 绿色荧光蛋白标记 发酵 优化
分类号: S436.412.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


番茄原产于南美洲,有较好的营养价值和经济效益。近年来,设施番茄种植面积不断扩大,高温高湿的设施环境给各种病虫害提供了有利的生长、繁殖条件,设施蔬菜病害频繁暴发,而土传病害(青枯病、枯萎病等)是影响设施番茄生产的主要病害。而使农产品产量大幅度降低,带来严重的经济损失。本文从宁夏、江苏和福建等地的连作番茄、辣椒、西瓜等作物的根际土壤中分离、筛选出对番茄青枯病和枯萎病均有防治效果的拮抗细菌,对拮抗菌株的盆栽防效和田间防效测定,检测其产生的抑菌物质,对其进行种属鉴定；并将防效最好的枯草芽孢杆菌PTS-394进行绿色荧光蛋白标记,以研究其在番茄根际土壤中的定殖动态；同时也对PTS-394的发酵培养基和培养条件进行了优化。主要结果如下：(1)从宁夏银川、江苏沭阳和福建厦门的番茄、辣椒、西瓜等作物根际土壤中,分离纯化获得367个细菌分离物。以番茄枯萎病菌和番茄青枯病菌为靶标菌,从367株分离物中筛选出对两种病菌皆具有很强拮抗作用的菌株22株。拮抗细菌抑菌物质的研究结果表明：22株拮抗细菌均能分泌蛋白酶；不能分泌几丁质酶；3株细菌能分泌纤维素酶；3株细菌能分泌嗜铁素。盆栽实验结果表明：拮抗细菌PTS-394对番茄枯萎病和青枯病的防效最高,分别为77.40%和80.00%；菌株H-70、L-1和SJ-280对番茄枯萎病和青枯病的防效均大于60%。对这四株拮抗细菌进行16s rRNA种属鉴定,均为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).(2)选择防效最好的菌株PTS-394,为研究其在番茄根际土壤中的定殖规律,本实验构建一标记菌株,即将同时携带绿色荧光蛋白基因和氯霉素抗性基因的重组质粒pGFP22以电击转入生防菌株PTS-394内,于含氯霉素平板上培养后,在荧光显微镜下观察发光菌落,得到标记菌株PTS-GFP.对标记菌株进行生长速率和抑菌活性测定,测定结果表明,菌株进行绿色荧光蛋白基因标记对其生长没有明显影响,且室内抑菌实验结果显示,标记菌株对病原菌的抑菌活性与野生菌株没有明显差异。采用灌根法接种标记菌株,以稀释分离法和Real-Time PCR测定标记菌株PTS-GFP在番茄根际土壤的定殖动态。平皿稀释法实验结果表明,PTS-GFP在灌根0-15d时呈下降趋势,15d后下降速度稍缓,至30d时可保持相对稳定,约为6.5×104cfu/g,且RT-PCR法测得的定殖动态亦呈下降趋势,此与稀释分离法测得的结果一致。(3)本实验通过Plackett-Burman实验设计及Box-Behnken设计的响应曲面法(response surface methodology, RSM)对影响生防菌株PTS-394发酵培养基配方及培养条件进行了优化。实验结果表明,使PTS-394发酵菌含量和抑菌活性最大的成分关键因子的最优配比为：玉米淀粉11.48g/L、黄豆粉13.35g/L、酵母膏0.60g/L。此时菌含量预测值为4.43×109cfu/mL,抑菌带宽为6.20mm。以优化的培养基为基础,得到最优培养条件组合为：培养温度30.84℃、初始pH6.93和装液量65.15mL/250mL时,以2%接种量,150rpm,培养时间为48h,此时发酵活菌数和抑菌带宽的最大预测值为6.32×109cfu/mL和8.24mm。

全文目录


摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
上篇 文献综述  11-28
  第一章 番茄青枯病和枯萎病研究进展  12-20
    1 番茄青枯病和枯萎病病原菌  12-13
      1.1 番茄青枯病的病原  12-13
      1.2 番茄枯萎病的病原  13
    2 番茄青枯病和枯萎病症状  13-14
      2.1 番茄青枯病的症状  13-14
      2.2 番茄枯萎病的症状  14
    3 病害流行因素  14-15
      3.1 番茄青枯病流行因素  14-15
      3.2 番茄枯萎病流行因素  15
    4 青枯病菌和枯萎病菌致病机制研究现状  15-20
      4.1 青枯菌致病机制研究  15-16
      4.2 枯萎菌致病机制研究  16-20
  第二章 生防芽孢杆菌研究进展  20-24
    1 生防因子的种类  20-22
      1.1 生防细菌的应用  20-21
      1.2 生防放线菌的应用  21
      1.3 生防真菌的应用  21-22
    2 芽孢杆菌的研究现状  22-24
      2.1 芽孢杆菌(Bacillus)的生物学特性  22
      2.2 芽孢杆菌的控病作用机制  22-23
      2.3 生防芽孢杆菌的应用  23-24
  第三章 番茄青枯病和枯萎病的防治  24-28
    1 番茄青枯病的防治  24-25
      1.1 农业防治  24
      1.2 物理防治和化学防治  24
      1.3 生物防治  24-25
    2 番茄枯萎病的防治  25-27
      2.1 农业防治  25
      2.2 物理防治和化学防治  25-26
      2.3 生物防治  26-27
    3 研究番茄土传病害生物防治的目的和意义  27-28
下篇 研究内容  28-73
  第一章 番茄枯萎病和青枯病拮抗细菌的筛选、评价与鉴定  29-41
    摘要  29
    Abstract  29-30
    1 材料与方法  30-33
      1.1 供试材料  30-31
      1.2 样本采集及菌株分离、纯化和培养  31
      1.3 细菌的拮抗性能测定  31-32
      1.4 拮抗细菌抑菌物质的初步研究  32
      1.5 盆栽防效实验  32-33
      1.6 拮抗细菌的种属鉴定  33
    2 结果与分析  33-38
      2.1 细菌分离物对枯萎病菌和青枯病菌的抑制作用  33-37
      2.2 拮抗细菌的产酶和代谢物活性测定  37
      2.3 拮抗细菌对番茄枯萎病和青枯病的盆栽防治实验  37-38
      2.4 拮抗细菌种属的鉴定  38
    3 讨论  38-41
  第二章 生防菌PTS-394绿色荧光蛋白基因标记菌株的构建及其在番茄根际土壤中定殖能力研究  41-53
    摘要  41
    Abstract  41-42
    1 材料与方法  42-45
      1.1 供试材料  42-43
      1.2 枯草芽孢杆菌PTS-394绿色荧光蛋白标记菌株的构建  43
      1.3 标记菌株生长速率的测定  43-44
      1.4 标记菌株对病原菌的抑制作用  44
      1.5 标记菌株对番茄青枯病和枯萎病的盆栽防效及其在番茄根际定殖作用测定  44-45
    2 结果与分析  45-51
      2.1 电击转化得到绿色荧光蛋白标记菌株PTS-GFP  45-47
      2.2 标记菌株生长速度的测定  47
      2.3 标记菌株对病原菌的抑制活性  47-48
      2.4 平皿稀释分离培养法测定标记菌株在番茄根际土壤中的定殖量  48-49
      2.5 荧光定量PCR检测土壤总基因组DNA中标记基因的含量及变化  49-51
    3 讨论  51-53
  第三章 生防菌PTS-394发酵培养基及发酵培养条件的优化  53-73
    摘要  53
    Abstract  53-54
    1 材料与方法  54-56
      1.1 供试菌株和培养基  54
      1.2 种子液制备  54
      1.3 发酵液的无菌滤液的制备  54-55
      1.4 发酵液菌含量和抑菌活性的测定  55
      1.5 不同碳源、氮源对PTS-394发酵培养的影响  55
      1.6 发酵条件单因素对pts-394发酵培养的影响  55
      1.7 Plackett-Burman实验设计  55-56
      1.8 Box-Behnken响应曲面法(RSM)实验设计  56
      1.9 数据分析  56
    2 结果与分析  56-70
      2.1 发酵培养基的优化  56-65
      2.2 发酵培养条件关键因子的筛选  65-70
      2.3 实验结果的摇瓶发酵验证  70
    3 讨论  70-73
参考文献  73-85
全文总结  85-87
发表论文  87-89
致谢  89

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 病虫害及其防治 > 园艺作物病虫害及其防治 > 蔬菜病虫害 > 茄果类病虫害 > 番茄病虫害 > 病害
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