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苯脲类除草剂伏草隆免疫检测方法的研究

作　者: 张琳
导　师: 王硕
学　校: 天津科技大学
专　业: 食品科学
关键词: 伏草隆酶联免疫胶体金免疫层析试纸条水土壤
分类号: X592
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

伏草隆为内吸选择性土壤处理使用除草剂,属于苯脲类除草剂,这类农药可由地表径流,进入地下水和土壤,容易造成地下水和土壤污染。本实验成功的合成了伏草隆半被原、人工免疫原、酶标抗原、包被抗原,并利用伏草隆人工免疫原制备了具有的高特异性的苯脲类除草剂伏草隆的多克隆抗体。本实验对伏草隆的免疫分析方法进行了深入系统的研究,利用得到的多克隆抗体建立了两种简便、快速、实用的伏草隆免疫分析方法—直接竞争酶联免疫检测方法(ELISA)和免疫层析试纸条方法(GICA)。ELISA方法的灵敏度(IC50)为0.58±0.011μ/L,最低检出限(IC15)为0.08±0.021μg/L。除了与草不隆的交叉反应率为69.4%以外,与其他苯脲类除草剂交叉反应均较小。实验中选择了海河水、井水、自来水和土壤作为检测样品,通过优化条件消除基质影响,确定了样品的前处理方法,对样品进行了添加回收实验,ELISA方法的回收率在70-120%之间,变异系数在3.68-17.90%之间。此外,本实验采用高效液相方法对ELISA方法进行了验证,其相关性方程为y=1.124x+0.056,相关系数r2为0.986,充分说明了建立的伏草隆直接竞争ELISA检测结果的准确性和有效性。免疫层析试纸条的方法检出限20μg/L,选取海河水、自来水、井水阴性水样作为检测样品,分别添加5、10、20μg/L的伏草隆标准品,经0.22μm微孔滤膜过滤后直接上样,经免疫层析试纸条和ELISA检测,结果一致性良好,验证了免疫层析试纸条方法的准确性和有效性。同进本研究对免疫层析试纸条方法的方法特异性进行了检测,除草不隆、绿麦隆对方法的特异性有所影响外,其他苯脲类的除草剂对免疫层析试纸条方法无明显影响。所开发的胶体金试纸条无需检测仪器,操作简单,快速,10min内即可得出检测结果。实验结果稳定性高,可作为水样中伏草隆残留现场大量筛选的有效手段。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-9
1 前言  9-17
  1.1 我国农药残留现状  9-11
    1.1.1 农药残留的危害  9-10
    1.1.2 农药残留的控制措施  10-11
  1.2 ELISA方法和胶体金免疫层析试纸条方法简介  11-12
    1.2.1 ELISA方法简介  11-12
    1.2.2 胶体金免疫层析试纸条简介  12
  1.3 苯脲类残留的检测方法及研究进展  12-16
    1.3.1 大型仪器检测的方法  13
    1.3.2 免疫学检测方法  13
    1.3.3 国内外苯脲类检测技术及最新进展  13-14
    1.3.4 伏草隆概述及其研究进展  14-16
  1.4 本课题的研究目的及意义  16
  1.5 本课题的研究内容  16-17
2 材料和方法  17-30
  2.1 实验材料  17-19
    2.1.1 主要药品和试剂  17-18
    2.1.2 主要仪器和设备  18
    2.1.3 待测样品  18-19
    2.1.4 实验常用溶液的配制  19
  2.2 实验方法  19-30
    2.2.1 半抗原的设计与合成  19-21
    2.2.2 半抗原与蛋白的偶联  21-22
    2.2.3 多克隆抗体制备  22-23
    2.2.4 直接竞争ELISA方法实验条件优化  23-24
    2.2.5 直接竞争ELIA方法标准曲线的建立  24
    2.2.6 交叉反应率的测定  24-25
    2.2.7 添加回收实验  25
    2.2.8 直接竞争ELISA方法的验证  25
    2.2.9 直接竞争ELISA方法的精密度  25-26
    2.2.10 胶体金及胶体金探针的制备  26-27
    2.2.11 胶体金免疫试纸条方法层析条件的选择  27-29
    2.2.12 免疫层析试纸条检测限的确定  29
    2.2.13 免疫层析试纸条方法特异性的测定  29
    2.2.14 胶体金免疫试纸条应用于水样的检测  29-30
3 结果与讨论  30-48
  3.1 半抗原的鉴定  30-31
    3.1.1 半抗原Hapten A的结构鉴定  30
    3.1.2 半抗原Hapten B的结构鉴定  30-31
  3.2 抗体的制备  31-32
    3.2.1 抗血清效价与亲和力的测定  31
    3.2.2 抗血清的纯化  31-32
  3.3 直接竞争ELISA方法实验条件优化  32-35
    3.3.1 包被量的优化和酶标稀释倍数的优化  32
    3.3.2 封闭液选择的优化  32-33
    3.3.3 缓冲液pH值对ELISA的影响  33-34
    3.3.4 离子浓度的选择对ELISA的影响  34
    3.3.5 直接竞争ELISA方法标准曲线的建立  34-35
  3.4 交叉反应率的测定  35-36
  3.5 实际样品的检测  36-37
    3.5.1 实际水样(井水、自来水、海河水)的添加回收  36-37
  3.6 高效液相色谱方法的验证  37-38
  3.7 直接竞争ELISA方法的精密度  38-39
    3.7.1 板内变异  38
    3.7.2 板间变异  38-39
  3.8 胶体金的制备  39-40
  3.9 制备金标抗体最佳条件的优化  40-41
    3.9.1 胶体金连接抗体时pH的选择  40
    3.9.2 胶体金连接抗体量的选择  40-41
  3.10 层析条件的优化  41-42
    3.10.1 金标抗体稀释倍数的选择  41
    3.10.2 包被原稀释液的选择  41-42
  3.11 免疫层析试纸条组成材料的优化  42-44
    3.11.1 硝酸纤维素膜处理条件的选择  42
    3.11.2 样品垫处理条件的选择  42-43
    3.11.3 有机溶剂对检测限的影响  43-44
  3.12 免疫层析试纸条检测限的确定  44
  3.13 免疫层析试纸条方法特异性的测定  44-45
  3.14 实际水样的检测  45
  3.15 ELISA方法对免疫层析试纸条的验证  45-46
  3.16 试纸条的稳定性  46-48
4 结论  48-49
5 展望  49-50
6 参考文献  50-56
7 攻读硕士期间所发表论文  56-57
8 致谢  57

苯脲类除草剂伏草隆免疫检测方法的研究

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