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FMDV中和表位在HBc上的展示及其嵌合蛋白在重组腺病毒中的表达

作　者: 姜志刚
导　师: 于力
学　校: 中国农业科学院
专　业: 预防兽医学
关键词: 乙肝核心抗原 口蹄疫病毒 表位结构的展示 重组腺病毒
分类号: S855.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


口蹄疫(Foot-and-mouth disease, FMD)是主要感染偶蹄动物的一种急性、高度接触性传染病。该病以其流行广、传播快、危害大的特点成为威胁偶蹄动物的首位传染病。鉴于口蹄疫所带来的严重的经济和社会影响,国际兽医局(OIE)将其列为必须通报的疾病之一,我国也将其列为一类动物传染病的第一位。口蹄疫的病原为口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease Virus, FMDV),是小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属的唯一成员,共包括O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、Asia1型七个血清型,不同血清型间无交叉保护。该病毒的高度变异性是口蹄疫难于防控的主要原因。在我国,疫苗接种是防控FMD的主要手段。虽然目前广泛应用的全病毒灭活苗具有免疫原性强,保护力好等优点,但在应用过程中,也发现其具有免疫期短、副反应强及存在安全隐患等诸多缺陷,这使FMDV新型疫苗成为当今的研究热点,其中,利用病毒样颗粒展示FMDV抗原表位的表位展示疫苗,因其具有天然的抗原递呈特征、安全性好等优势而展现出广阔的开发前景。本研究选择乙肝核心抗原(Hepatitis B Virus core antigen, HBc)蛋白骨架作为载体,将Asia1型和O型FMDV的中和表位设计成特定的展示结构插入其中,由此构建的嵌合蛋白以pcDNA3.1(+)载体在真核细胞中瞬时表达,利用HBc的自组装特性,使特定结构的表位展示于病毒样颗粒的表面,通过间接免疫荧光试验检测展示表位的抗原活性。结果显示,将Asia1型FMDV模拟表位展示于HBc的N末端、将O型FMDV的真实表位单独展示在HBc的MIR区和N末端时,与表位相应的单克隆抗体呈现强反应,说明设计的表位结构已经得到正确的展示。随后,本研究又构建了在HBc的MIR区和N端同时插入FMDV表位的双表位展示载体以及表达该嵌合蛋白的重组腺病毒,结果表明,利用重组腺病毒表达双表位的表位-HBc嵌合蛋白不但实现了理想的表达效果、嵌合蛋白与相应单抗也呈现较强的反应活性。本研究通过在HBc上展示FMDV的中和表位,以及将表位与HBc嵌合蛋白在腺病毒载体中表达,为FMDV表位展示疫苗的研制建立了理论与实验基础。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-12
英文缩略表  12-13
第一章 引言  13-24
  1.1 口蹄疫  13-17
    1.1.1 口蹄疫病毒的一般特征  13-14
    1.1.2 口蹄疫病毒的基因组结构  14
    1.1.3 口蹄疫病毒结构蛋白的结构及功能  14-15
    1.1.4 口蹄疫病毒的抗原结构  15-17
      1.1.4.1 抗原位点和抗原表位  15-16
      1.1.4.2 口蹄疫病毒的抗原位点和抗原表位  16
      1.1.4.3 口蹄疫病毒抗原表位的研究目标  16-17
  1.2 口蹄疫疫苗研究进展  17-19
    1.2.1 传统疫苗  17
    1.2.2 基因工程亚单位疫苗  17-18
    1.2.3 合成肽疫苗  18
    1.2.4 病毒活载体疫苗  18
    1.2.5 核酸疫苗  18-19
  1.3 表位展示疫苗的研究  19-21
    1.3.1 病毒样颗粒表位展示疫苗的研究  19-20
    1.3.2 HBc病毒样颗粒载体的研究进展  20-21
  1.4 腺病毒载体疫苗研究进展  21-22
    1.4.1 腺病毒概述  21
    1.4.2 腺病毒载体的分类  21-22
    1.4.3 腺病毒载体在FMD疫苗研究中的应用  22
  1.5 本试验室的研究基础  22
  1.6 本研究的目的和意义  22-24
第二章 Asia1型FMDV模拟表位S7在HBc载体N末端的展示  24-29
  2.1 材料与方法  24-26
    2.1.1 细胞和载体  24
    2.1.2 工具酶与主要试剂  24
    2.1.3 仪器设备  24
    2.1.4 表位基因的设计与合成  24-25
    2.1.5 构建pcDNA3.1(+)-HBC-NS7重组质粒  25-26
      2.1.5.1 表位基因和载体片段的制备  25
      2.1.5.2 表位基因和载体片段的连接、转化及重组质粒的鉴定  25-26
    2.1.6 pcDNA3.1(+)-HBC-NS7重组质粒瞬时转染BHK-21细胞  26
    2.1.7 间接免疫荧光(IFA)检测重组质粒的表达效果  26
  2.2 结果  26-28
    2.2.1 表位单核苷酸链退火产物鉴定  26-27
    2.2.2 阳性重组质粒的鉴定  27
    2.2.3 重组质粒在BHK-21的表达及S7展示于HBc载体N末端的反应活性  27-28
  2.3 小结  28
  2.4 讨论  28-29
第三章 O型FMDV真实表位和模拟表位在HBc载体MIR区和N末端的展示  29-38
  3.1 材料与方法  29-32
    3.1.1 细胞和载体  29
    3.1.2 工具酶与主要试剂  29
    3.1.3 仪器设备  29
    3.1.4 同源建模  29-30
    3.1.5 表位基因的合成  30-31
    3.1.6 在HBc载体MIR区和N端展示O型FMDV真实表位和模拟表位重组质粒的构建  31-32
      3.1.6.1 表位基因和载体片段的制备  31
      3.1.6.2 表位基因和载体片段的连接、转化及重组质粒的鉴定  31-32
    3.1.7 重组质粒瞬时转染BHK-21细胞  32
    3.1.8 间接免疫荧光检测展示表位与相应单抗的反应活性  32
  3.2 结果  32-34
    3.2.1 展示于HBc载体MIR区表位的同源建模  32-33
    3.2.2 阳性重组质粒的鉴定  33
    3.2.3 重组质粒在BHK-21的表达及S7展示于HBc载体N末端的反应活性  33-34
  3.3 小结  34
  3.4 讨论  34-38
第四章 HBc载体展示的FMDV中和表位在重组腺病毒中的表达  38-49
  4.1 材料与方法  38-43
    4.1.1 细胞、质粒  38
    4.1.2 工具酶和主要试剂  38
    4.1.3 仪器设备  38
    4.1.4 引物的设计与合成  38-39
    4.1.5 构建HBc载体MIR区和N区各展示一个表位的双表位重组质粒  39
    4.1.6 双表位与HBc嵌合蛋白的瞬时表达及其病毒样颗粒的观察  39
      4.1.6.1 间接免疫荧光检测表位的反应活性  39
      4.1.6.2 HBc-dS7和HBc-dO1病毒样颗粒的观察  39
    4.1.7 构建重组腺病毒质粒  39-41
      4.1.7.1 目的基因的扩增  39-40
      4.1.7.2 重组腺病毒穿梭质粒的构建及鉴定  40
      4.1.7.3 重组腺病毒质粒的制备  40-41
      4.1.7.4 重组腺病毒质粒的鉴定  41
    4.1.8 重组腺病毒质粒的扩增及Pac Ⅰ线性化  41
    4.1.9 重组腺病毒的制备  41-42
      4.1.9.1 转染前AD-293细胞的准备  41-42
      4.1.9.2 经Pac Ⅰ线性化的重组腺病毒质粒转染AD-293细胞  42
      4.1.9.3 重组腺病毒的传代  42
    4.1.10 重组腺病毒的鉴定  42-43
      4.1.10.1 间接免疫荧光检测双表位-HBc嵌合蛋白的表达  42
      4.1.10.2 Dot-ELISA检测检测双表位-HBc嵌合蛋白的表达  42-43
      4.1.10.3 噬斑法测定重组病毒的滴度  43
  4.2 结果  43-47
    4.2.1 pcDNA 3.1(+)-HBc-dS7和PcDNA3.1(+)-HBc-dO1双表位重组质粒在BHK-21细胞中的表达  43-44
    4.2.2 HBc-dS7和HBc-dO1病毒样颗粒形态  44
    4.2.3 目的基因的扩增结果  44
    4.2.4 重组穿梭质粒的鉴定  44-45
    4.2.5 重组腺病毒质粒的鉴定  45-46
    4.2.6 重组腺病毒的鉴定  46-47
      4.2.6.1 重组腺病毒引起的CPE  46
      4.2.6.2 间接免疫荧光检测HBc-dS7、HBc-dO1嵌合蛋白的表达  46-47
      4.2.6.3 Dot-ELISA检测检测HBc-dS7、HBc-dO1嵌合蛋白的表达  47
    4.2.7 重组腺病毒滴度的测定  47
  4.3 小结  47-48
  4.4 讨论  48-49
第五章 全文结论  49-50
参考文献  50-56
致谢  56-57
作者简介  57

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医传染病学 > 病毒病
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